瘦素基因启动子G-2548A多态性与青年高血压的相关性研究

【摘要】  目的 探讨瘦素基因多态性与青年人高血压的相关性。方法 采用PCR-RFLP技术对98例青年高血压患者、105例青年血压正常者和86例老年高血压者的瘦素基因G-2548A位点多态性进行研究，并分析比较三组人群该基因基因型及等位基因的分布。 结果 青年高血压组AG/GG基因型频率和G等位基因频率明显高于青年正常对照组(P<0.05);青年高血压组AG/GG基因型频率和G等位基因频率明显高于中老年高血压病例组 (P<0.05)。结论 青年高血压组G等位基因频率明显高于青年正常组和中老年高血压组，瘦素基因启动子G-2548A多态性可能与青年人高血压存在关联。

【关键词】  高血压;青年人;瘦素基因;多态性

　原发性高血压是影响冠心病、中风、肾脏等疾病发病和死亡的重要危险因素[1-2]。近年来人群高血压患病率逐年升高并呈现发病年龄提前的趋势，本研究分析瘦素基因(leptin gene,LEP)多态性与青年高血压的相关关系，将从分子生物学水平探讨遗传背景对原发性高血压,特别是早发原发性高血压的影响，并通过现场调查提高青年人群对高血压的认识，为早期预防控制和治疗高血压提供依据和指导。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　研究对象均来自2006-2008年开展的宁夏地区人群慢性病相关因素调查中自愿采血的人群。青年高血压组98例，其中男45例，女53例，年龄(37.38±6.29)岁;青年血压正常组105例，年龄(35.95±5.06)岁;中老年高血压组86例，年龄(59.08±4.00)岁。高血压判断标准：采用1999年WHO/ISH确定的标准将收缩压(SBP)≥140mmHg和(或)舒张压(DBP)≥90mmHg或调查时血压正常但既往有高血压病史且正在服用降压药者均诊断为高血压。世界卫生组织于2000年提出了新的年龄划分法：45岁以下为青年，45～59岁为中年，60～74为年轻的老人或老年前期，75～89岁为老年，90岁以上为长寿老人。核心论文发表网

　　1.2 基因多态性分析方法 收集EDTA抗凝血3mL，采用酚/氯仿法提取基因组DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测瘦素基因启动子区G-2548A位点多态性。PCR扩增引物根据文献[3]设计，由北京奥科生物公司合成;上游引物：5'-TTT CCTGTA ATT TTC CCG TGA G-3'，下游引物：5'-AAAGCA AAG ACA GGC ATA AAA A-3'。PCR扩增体系为50μL，包括模板DNA 5μL，上、下游引物各1.5μL (0.30μmol·L-1)，dNTP 4μL (200μmol·L-1)，10×buffer 5μL,Taq酶(天津天根生物公司) 1μL(2.5μmol·L-1)。应用BIO-RAD全自动基因扩增仪扩增目的片段。反应条件为：94℃5min， 94℃45s，52.6℃45s，72℃45s,循环30次,最后72℃延伸7min。扩增产物为242bp经HhaI限制性内切酶(promega公司)37℃消化6h,消化产物(瘦素基因扩增产物12μL, 10×Buffer 2.0μL, HhaI限制性内切酶0.5μL, BSA 0.2μL，ddH2O 5.3μL, 总体积20μL)经2%的琼脂糖凝胶电泳及溴化乙啶染色鉴定。基因型判断：在瘦素基因5' 端末翻译区2548位存在G→A的多态性，2548位为G等位基因时存在HhaI限制性内切酶酶切位点，而为A等位基因时该酶切位点消失。因此，当瘦素基因型为GG时，两个等位基因均有切点，酶切产物电泳后有181bp和61bp两条带;AA基因型时，两个等位基因均无切点，酶切产物电泳后为242 bp一条带;AG基因型时，一个等位基因有切点，另一个等位基因无切点，酶切产物电泳后为242 bp、181bp和61bp三条带，见图1(封3)。

　　1.3 统计学方法 统计分析使用SPSS 11.5软件包。χ2吻合度检验各组基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡法则,基因型及等位基因频率差异比较采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 青年高血压病例组与青年正常对照组瘦素基因基因型及等位基因分布频率的比较 见表1。

　　经吻合度检验,青年高血压组、青年正常对照组两组基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡法则(P>0.05)。经卡方检验,两组间AA和AG/GG基因型分布差异有统计学意义(χ2=6.530，P=0.011),等位基因在两组的分布频率差异有统计学意义(χ2=8.262，P=0.004)。青年高血压组AG/GG基因型频率(46.9%)和G等位基因频率(28.6%)明显高于青年正常对照组的(29.5%)和(16.7%)。表1 青年高血压病例组与青年正常对照组LEP基因型及等位基因分布频率的比较

　　组别基因型/%AAAG+GG等位基因/%AG青年高血压组52(53.1)46(46.9)140(71.4)56(28.6)青年正常组74(70.5)31(29.5)175(83.3)35(16.7)χ2值6.5308.262P值0.0110.0042.2 青年高血压病例组与中老年高血压病例组LEP基因型及等位基因分布频率的比较 见表2。

　　经吻合度检验, 青年高血压组、中老年高血压病例组两组基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡法则 (P>0.05) 。经卡方检验, 两组间 AA 和AG/GG 基因型分布差异有统计学意义(χ2= 7.970, P=0.005),等位基因在两组的分布频率差异有统计学意义(χ2= 9.577,P=0.002)。青年高血压组AG/GG基因型频率(46.9%)和G等位基因频率(28.6%)明显高于中老年高血压病例组的(26.7%)和(15.1%)。表2 青年高血压病例组与中老年高血压病例组LEP基因型及等位基因分布频率的比较

　　组别基因型/%AAAG+GG等位基因/%AG青年高血压组52(53.1)46(46.9)140(71.4)56(28.6)中老年高血压组63(73.3)23(26.7)146(84.9)26(15.1)χ2值7.9709.577P值0.0050.0023 讨论

　　人类瘦素基因位于人染色体7q31,是限制食物摄入和增加能量消耗的信号分子[4]。2002年有研究首次发现瘦素基因启动子区 G-2548A 突变与肥胖有关，并分析得出该多态性增加了瘦素基因的表达和脂肪瘦素的分泌[5]。因此随着瘦素基因功能的明确，广泛的研究证实了瘦素基因多态性与肥胖、糖尿病、心血管等疾病的关联[6-7]。同时多人研究得出瘦素基因多态性与血压及高血压相关联[8-9]，并有研究发现瘦素基因与高血压的关联性是独立于肥胖因素的[10]。
　本文以瘦素基因 G-2548A 变异为标记，探讨宁夏地区青年人群中瘦素基因的变异与高血压易感性的关系。发现青年高血压患者和正常对照之间，瘦素基因启动子 G-2548A 多态性分布存在差异，其中青年高血压患者 AA+ AG 基因型频率和 G 等位基因的频率较对照组明显增高(P均<0.05)，因此，瘦素基因启动子 G-2548A 多态性与高血压密切相关，G等位基因可能是高血压发病的遗传易感因素。同时我们还比较了高血压病例组内不同年龄结构人群中瘦素基因启动子 G-2548A位点基因型和等位基因频率,发现青年患者中的AA+AG基因型及G等位基因频率要显著高于老年患者(P<0.05) ，表明G等位基因在促进原发性高血压早期发生方面的作用不容忽视。

　　高血压流行病学资料表明,我国原发性高血压的发病率逐年升高,并且其起病年龄也日趋年轻化[11],其根本原因尚不清楚。原发性高血压是环境因素参与下的多基因遗传性疾病[12],而早期发病现象是遗传性疾病的共同特点。青年原发性高血压患者作为一个重要的群体,越来越受到广大研究者的重视。随着遗传性关联分析和连锁分析方法的应用,以及转基因高血压动物模型的实验成功,目前深入研究基因与原发性高血压的关联性已经成为目前该病病因学研究的主要方向。本研究发现该多态性与早发原发性高血压存在紧密的联系,瘦素基因 G-2548A AG+GG基因型及G等位基因明显增加了青年人群罹患原发性高血压的危险性,并促进原发性高血压的早期发生。我们认为,对该位点基因多态性的检测将有助于阐明早发原发性高血压的遗传本质和发病机制,将会对高血压的临床分型、预后判断、个体化治疗和易感人群的早期检出及预防产生重要影响。

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