血液中大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因型研究
【摘要】 目的 了解本地区血液标本中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的分离率、耐药性和基因型。方法 收集临床血液标本分离的产ESBLs的大肠埃希菌26株，应用PCR基因扩增技术分别检测SHV、TEM、CTX-M、PER、CTX-M-2、Ampc、GES基因，DNA测序确定CTX-M、TEM基因型。结果 在26株菌株中15株为CTX-M型,占57.69%，11株为TEM型,占42.31%。结论 本地区临床血液标本分离的产ESBLs大肠埃希菌流行的主要基因型是CTX-M型和TEM型。
【关键词】 大肠埃希菌；超广谱β-内酰胺酶；基因型；血液标本
Abstract: Objective To investigate the isolation rate, antibiotic susceptibility and ESBLs′ genotypes of the Escherichia coli strains isolated from local blood samples. Methods 26 clinical strains of E.Coli expressing ESBLs isolated from blood were collected. The genotypes of SHV, TEM, CTXM, PER, CTXM2, AmpC and GES genes were analyzed by PCR and CTXM, TEM genotype were determined by DNA sequencing.Results There were 15 strains expressing blaCTXM gene and 11 strains expressing blaTEM gene among 26 strains.Conclusion Results shows that CTXMtype and TEMtype are predominant genotypes of ESBLs in E.coli strains isolated from local blood samples.
Key words: escherichia coli; ESBLs; genotype; blood sample音乐论文发表
超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum-laetamases，ESBLs)主要由肠杆菌科的细菌产生,以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为代表［1］，是临床肠杆菌科细菌对第三代头孢菌素耐药的重要机制。ESBLs型细菌对多种抗生素耐药,易引起医院院内暴发流行，血液中一旦出现产ESBLs的大肠埃希菌，可引起多器官甚至全身感染，给临床治疗带来极大困难，因此进行本地区临床血液标本中分离的ESBLs型菌的耐药性监测及耐药分子流行病学研究，对血液流行感染性疾病的预防控制尤为重要。由于抗生素使用情况差异，不同国家、地区ESBLs种类不同，国内报道以SHV和CTX-M型较为常见［2-3］，为了解本地区血流感染ESBLs型大肠埃希菌的耐药情况，对宁夏医科大学附属医院2005年1月至2008年5月临床血液标本分离的26株ESBLs阳性菌株耐药性和基因型报告如下。
1 材料
1.1 菌株来源
临床血液标本中连续分离出无重复（同一患者同一部位只取第一次分离标本）26株ESBLs阳性菌株。
1.2 主要试剂
分离鉴定培养基、M-H琼脂干粉和药敏纸片（英国 Oxoid 公司）；2000 DNA Marker、蛋白酶K、Takara Tag 酶（大连宝生物公司）；引物由上海生物工程公司合成。
1.3 主要仪器
VITEK-32全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司）；DB-920全自动血培养仪；ND-1000核酸蛋白测定仪（美国Nano Drop公司）；Eppendorf PCR仪（德国）；电泳仪、凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。
2 方法
2.1 菌株鉴定
所有菌株采用法国生物梅里埃公司VITEK-32全自动微生物分析仪鉴定及药敏试验鉴定菌种，得到初步ESBLs的结果。
2.2 ESBLs确证试验
采用美国临床实验室标准化委员会（CLSI）推荐的纸片扩散法进行ESBLs表型确证［4］，质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。
2.3 药敏试验
按K-B法将待测菌液接种M-H平皿上，贴上抗生素纸片，35℃培养18-24h，测量抑菌圈直径，按CLSI标准判断敏感率(S)、中介率（I）、耐药率(R)，共采用15种抗生素。
2.4 细菌质粒DNA的提取
采用传统的煮沸法提取质粒DNA［5］，调整菌液的浓度使得OD260/OD280在0.4～0.6之间，作为模板液备用。
2.5 设计靶基因PCR扩增反应体系
总反应体积25μL，其中10× buffer 2.5μL，dNTP 4μL，primer 0.6×2μL，TaqE 0.4μL，模板1μL，用ddH2O补足至25μL。热循环参数为:预变性(94℃ 10min) →变性（94℃ 30s）→退火→延伸（72℃ 60s）,循环35周期, 最后1个72℃延长至5min。反应的退火温度根据每对上下游引物单独设计。靶基因PCR引物序列由上海生物工程公司合成（引物序列见参考文献［6］）。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后,用溴化乙锭(10mg/mL)染色，凝胶成像系统进行结果分析。各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。
2.6 PCR产物的基因测序
随机抽取各基因型阳性菌株2株，用美国应用生物系统公司ABI377自动DNA测序仪进行序列分析(由北京诺赛基因测序公司完成)。DNA测序结果通过美国NCBI网站BLASTN软件与GenBank数据库进行比对分析。表1 β-内酰胺酶引物序列（略）
3 结果
3.1 耐药率
26株产ESBLs酶的大肠埃希菌对15种抗菌药物耐药率的分析，见表2。表2 26株产ESBLs菌株对15种抗生素的耐药情况（略）
3.2 基因型检测结果
26株产ESBLs大肠埃希菌基因型检测结果，见表3。ESBLs 的CTX-M、TEM基因型的PCR凝胶电泳见图1。表3 26株产ESBLs大肠埃希菌基因型检测结果（略）
3.3 基因测序结果 音乐论文发表
从TEM和CTX-M阳性菌株中分别随机选取2株进行测序，测序结果与GenBank报道的序列进行比较，其同源性均达到99%以上。
4 讨论
ESBLs是存在于细菌中的丝氨酸蛋白酶的衍生物，它能水解β-内酰胺环，尤其是头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南等广谱头孢菌素，可通过质粒形式在细菌之间传播［7］。自1983年在德国发现第1例ESBLs以来［8］，其发生率呈逐年上升趋势。至今世界各地已经出现了200多种ESBLs，如美国主要为TEM-2、10，法国主要为TEM-24、TEM-3、SHV-4，而中国主要为SHV、 CTX-M基因型［2-3］。从表2可知，本地区血液中产ESBLs大肠埃希菌中TEM、CTX-M型酶是最常见的β-内酰胺酶，这与国内报道的ESBLs基因型别有一定差别［2-3］。TEM型ESBLs是由产广谱β-内酰胺酶基因TEM-1型或TEM-2型经过1个或多个位点突变而形成的。本研究检测到11株产ESBLs的大肠埃希菌带有TEM型质粒，可能与本地医院大量使用头孢他啶有关。CTX-M型ESBLs特征是对头孢噻肟和头孢曲松的水解力很强，而对头孢他啶的水解能力相对较弱。本研究显示，15株菌带有CTX-M型质粒，很可能与本地医院以头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮等三代头孢菌素长期大量使用，导致细菌质粒耐药基因突变或选择性细菌耐药株产生有关。另外，本研究可能由于标本量少未检出其他基因型别，其他型别检出率低，与参考文献报道的一致［9-10］。
从表3可知，本地区血液中产ESBLs大肠埃希菌对亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率低,分别为0、11.8%，提示临床治疗该菌引起的感染时可以选用以上药物；对氨曲南、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢唑啉等抗生素的耐药率很高，分别为100%、96.20%、96.20%、92.30%，提示这些菌株可能携带ESBLs耐药基因，在临床选用治疗血液感染时，应尽量避免选用此类抗生素。
本研究中所检出血液中大肠埃希菌ESBLs型别主要为TEM、CTX-M。为防止更多的ESBLs基因型别输入本地或者本地型别输出，应加强ESBLs型菌耐药性监测及其分子流行病学研究，指导临床合理使用抗生素，提高医院对ESBLs型菌防控意识，将其危害降到最低程度。
【参考文献】
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