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实时荧光定量PCR检测人IL9 mRNA方法的建立及应用

作者:时间:2011-03-24 14:21:30 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:1008次 ]

【摘要】目的：建立检测人白介素9 (interleukin9，IL9) mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR, qRTPCR)方法。方法：分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，经PMA和离子霉素刺激活化后提取总RNA并逆转录成cDNA。扩增产物与pMD18T载体连接构建质粒标准品。采用qRTPCR方法检测IL9 mRNA的表达水平。评价该方法的线性及特异性，应用该方法检测Graves病患者PBMC中IL9 mRNA 表达水平。结果：建立了人IL9的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该法的标准曲线相关系数r2为0.995～0.998，熔解曲线分析产物为单峰。Graves病患者PBMC中IL9 mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组(P<0.01)。结论：建立的检测人IL9 mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法灵敏、特异性好，为进一步临床应用提供了实验基础。

【关键词】白细胞介素9; 实时荧光定量PCR; SYBR GreenⅠ

　　[Abstract] Objective: To establish a SYBR GreenⅠ based realtime fluorescence quantitative PCR (qRTPCR) method for detection human interleukin9 (IL9) mRNA expression. Method: The specific primers were designed according to the conserved sequence of human IL9 gene. Total RNAs were extracted from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which were stimulated by PMA and ionomycin, then the RNAs were transcribed reversely into cDNAs. The plasmid standards were constructed. The sensitivity and specificity of the method were eva luated. The relative expression levels of human IL9 mRNA in PBMCs from patients with Graves′ disease (GD) and healthy controls were detected by this method. Results: The coefficient of correlation of the standard curve of this method was 0.995-0.998, melting curve analysis showed single peak. The relative expression levels of human IL9 mRNA in GD group were higher than that in healthy control group (P<0.01). Conclusion: The method to detect IL9 by SYBR GreenⅠbased qRTPCR was good in sensitivity, specificity and linear function. It can be used as a standard method of qRTPCR for detection of human IL9 expression.

　　[Key words] interleukin9; realtime fluorescence quantitative PCR; SYBR GreenⅠ

　　早先认为IL9是由Th2细胞分泌的一种细胞因子，在抗寄生虫感染及过敏性哮喘中发挥重要作用。近期研究发现有一种新的CD4+T细胞亚群，主要分泌IL9及IL10，称之为“Th9细胞”, 在炎症反应及自身免疫性疾病中发挥重要的作用[1-3]。我们建立了一种检测人IL9 表达的实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR, qRTPCR)方法，并应用于Graves病患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中人IL9 mRNA的检测，为进一步研究IL9在临床中的应用提供了实验手段。历史论文发表

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 研究对象 Graves病患者组22例(男5例，女17例)，平均年龄(31.4±9.4)岁，均为经江苏大学附属人民医院确诊的初诊患者。健康对照组20例(男5例，女15例)，平均年龄(29.6±10.3)岁，无慢性疾病及自身免疫性疾病。

　　1.1.2 主要试剂和仪器人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物技术有限公司)，RPMI1640培养基(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)、离子霉素(Sigma公司)，Trizol(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒FSK101(ToYoBo公司)，rTaq酶、dNTPs、10×PCR 缓冲液、pMD18T载体、BamH Ⅰ 、Hind Ⅲ(TaKaRa公司)，荧光定量PCR试剂盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMixUDG with ROX(Invitrogen公司)，Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪(Stratagen公司)，pMD18Tβ肌动蛋白质粒由本实验室构建并保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计及合成利用Oligo 6.0软件根据基因库中IL9(NM_000590)的序列设计PCR引物。IL9：上游引物5′CCAGCTTCCAAGTGCCACTGC3′; 下游引物5′TGCATGGTGGTATTGGTCATCTG3′;扩增片段125 bp。β肌动蛋白：上游引物5′CACGAAACTACCTTCAACTCC3′;下游引物5′CATACTCCTGCTTGCTGATC3′;扩增片段262 bp[4]。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2.2 样本处理取5 ml肝素抗凝静脉血，使用人淋巴细胞分离液分离PBMC，用RPMI1640完全培养基调整细胞密度为1×106/ml，取1 ml放入24孔板，以50 ng/ml PMA和1 μg/ml离子霉素于5%CO2、37℃刺激培养5 h后收集细胞，加入1 ml Trizol试剂裂解细胞，提取总RNA。用逆转录试剂盒以Oligo(dT)20将总RNA逆转成cDNA。反应条件：42℃，20 min;99℃，5 min;4℃，5 min。合成的cDNA存于-20oC冰箱备用。

　　1.2.3 pMD18TIL9重组质粒的构建以上述制备的cDNA为模板，利用PCR扩增IL9片段。反应条件：94℃预变性5 min;94℃，30 s;58℃，30 s;72℃，30 s;35个循环;72℃，7 min。将PCR产物与pMD18T载体进行TA克隆，经BamH Ⅰ 酶切、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定，阳性克隆送上海英骏公司测序，证实与基因库中IL9序列完全一致。阳性克隆菌株通过LB培养基扩增，抽提并纯化质粒，将纯化质粒稀释成102～107/μl作为标准品，于-20℃冰箱保存备用。

　　1.2.4 标准曲线的制备以稀释的标准品作为模板在荧光定量PCR仪上进行扩增，制备标准曲线。根据试剂盒说明：50℃ 2 min;95℃ 预变性2 min;95℃ ，15 s; 58℃(IL9)/56℃ (β肌动蛋白)，20 s;82℃(IL9)/86℃(β肌动蛋白)8 s;扩增40(IL9)/30(β肌动蛋白)个循环。为避免引物二聚体干扰，分别在82℃(IL9)/86℃(β肌动蛋白)收集荧光信号。扩增结束后由仪器软件绘制标准曲线。

　　1.2.5 特异性的评价标准品及临床标本cDNA在荧光定量PCR仪上进行扩增后进行熔解曲线分析，检测PCR产物是否为目的产物，分析该方法的特异性。

　　1.2.6 样本IL9 mRNA相对表达量的检测将样本cDNA、标准品、空白对照以上述反应体系及条件同时进行扩增，根据标准曲线分别检测每个样本的IL9和β肌动蛋白的拷贝数，并以β肌动蛋白为参照校准IL9的相对表达。

　　1.2.7 统计学分析利用SPSS12.0软件进行统计分析。数据以中位数及四分位数间距(interquartiles range, IQR)表示，组间比较采用MannWhitney检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果

　　2.1 人IL9 mRNA SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法学的建立

　　2.1.1 pMD18TIL9重组质粒的鉴定 pMD18TIL9重组质粒经BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ双酶切，可见2560 bp的载体片段及164 bp小片段，同时经PCR扩增出125 bp的片段(图1)。质粒测序结果显示其序列与IL9基因序列完全一致，从而证实pMD18TIL9阳性质粒构建成功。

　　1：TaKaRa DL2000 DNA 标准参照物; 2：pMD18TIL9质粒PCR产物; 3：pMD18TIL9 BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切; 4：pMD18TIL9质粒 BamH Ⅰ酶切; 5：TaKaRa 250 bp 标准参照物

　　图1 pMD18TIL9重组质粒的鉴定结果

　　Fig 1 Identifying result of recombinant plasmid pMD18TIL9

　　2.1.2 IL9标准质粒的扩增曲线及标准曲线将构建成功的pMD18TIL9质粒稀释10倍为107～102 拷贝数/μl作为模板进行扩增，制备其标准曲线。其扩增曲线见图2a，其标准曲线如图2b所示。相关系数r2 为0.995～0.998;斜率M为-3.252。其扩增效率为103%。

　　2.1.3 qRTPCR检测IL9 mRNA方法的特异性为检验该方法的特异性，在每次扩增后均进行熔解曲线分析，由图3可以看出质粒标准品和临床标本cDNA的扩增产物为单一峰，表明只有IL9目的基因的扩增而无其他杂带，特异性好。

　　2.2 Graves病患者PBMC中IL9 mRNA相对表达水平的检测历史论文发表

　　Graves病组和健康对照组的IL9 mRNA相对表达水平以IL9/β肌动蛋白比值表示。图4显示Graves病组和健康对照组的比值分别为0.0003(IQR 0.00004～0.001)和 0.0018(IQR 0.001～0.004)，两者比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　3 讨论

　　机体内CD4+T细胞是包括许多亚群的异质性细胞，在体内微环境的作用下，能分化成不同类型具有不同免疫功能的亚群，如Th1、Th2、Treg及Th17等 [5]。Th1主要分泌IFNγ、IL2 、TNFβ ，主要介导细胞免疫; Th2主要分泌IL4和IL5，介导体液免疫和抗寄生虫感染;Treg细胞在体内调节Th细胞和Tc细胞使之处于动态平衡从而维护机体的免疫自身稳定[6]; Th17主要分泌IL17、IL22 等因子，在自身免疫性疾病的发生及抗感染中发挥重要作用[7]。最近，又鉴定出“Th9”细胞，为已有的Th细胞亚群又增添了新成员。TGFβ1及IL4的联合作用可使抗原刺激活化的初始型CD4+ T细胞分化为Th9细胞[1]。Th2细胞在TGFβ1的作用下也可转分化为Th9细胞[2]。原认为是Th2类细胞因子的IL9，现认为是由Th9细胞分泌，因此检测IL9的表达对研究Th9细胞分化及其在自身免疫性疾病、慢性炎症、肿瘤等疾病中的作用有着重要的临床和科研意义。

　　Graves病是一种器官特异性自身免疫性疾病，机体产生抗促甲状腺激素受体及甲状腺球蛋白等自身抗体[8]，其具体的致病机制还未阐明，传统上大多数学者认为Graves病是由体液免疫应答异常所引起的[9]，但Th9细胞在Graves病中的作用未见报道。本研究中，我们发现Graves病患者外周血中IL9 mRNA的表达水平明显高于健康对照组(P<0.01)，这提示患者体内可能存在着Th9细胞的极化及IL9, IL10等细胞因子表达增强的现象，为探究Graves病的致病机制及治疗手段提供了新的思路。

　　本研究建立了一种检测人IL9 mRNA的 qRTPCR方法。在pMD18TIL9质粒标准品为102～107/μl范围内，该方法标准曲线的相关系数为0.998，说明该方法的线性较好，灵敏度高;斜率为-3.252具有很好的扩增效率(103%)。同时，样本cDNA扩增后的熔解曲线呈单个峰，只有目的基因而无引物二聚体等非特异性扩增产物，说明该方法的特异性较好。因此，本研究建立的检测人IL9 mRNA的qRTPCR方法特异、灵敏，能够准确检测IL9 mRNA的含量，从而为进一步的临床检测提供了实验基础。

【参考文献】
　[1] Dardalhon V, Awasthi A, Kwon H, et al. IL4 inhibits TGFbetainduced Foxp3+ T cells and, together with TGFbeta, generates IL9+ IL10+ Foxp3(-) effector T cells[J]. Nat Immunol, 2008,9(12):1347-1355.

　　[2] Veldhoen M, Uyttenhove C, van Snick J, et al. Transforming growth factorbeta ‘reprograms’ the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9producing subset[J]. Nat Immunol, 2008,9(12):1341-1346.

　　[3] 田洁,王胜军,许化溪. Th9细胞：一种新型效应性CD4+T细胞亚群[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2009,25(9):853-855.

　　[4] 吴蔚,王胜军,李遇梅,等.皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGFβ1mRNA表达及意义[J]. 江苏大学学报:医学版, 2008, 18(3): 255-257.

　　[5] Zhu J, Paul WE. CD4 T cells: fates, functions, and faults[J]. Blood,2008,112(5):1557-1569.

　　[6] Green EA, Gorelik L, McGregor CM, et al.CD4+CD25+ T regulatory cells control antiislet CD8+ T cells through TGFbetaTGFbeta receptor interactions in type 1 diabetes[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003,100(19):10878-10883.

　　[7] Liang SC, Tan XY, Luxenberg DP, et al. Interleukin (IL)22 and IL17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides[J]. J Exp Med, 2006,203(10):2271-2279.

　　[8] Weetman AP. Autoimmune thyroid disease: propagation and progression[J]. Eur J Endocrinol,2003,148(1):1-9.

　　[9] Chen B, Tsui S, Boeglin WE, et al. Interleukin4 induces 15lipoxygenase1 expression in human orbital fibroblasts from patients with Graves disease. Evidence for anatomic siteselective actions of Th2 cytokines[J].J Biol Chem, 2006,281(27):18296-18306.

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