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四种微量石蜡组织DNA提取方法的比较

作者:时间:2011-02-10 15:58:58 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:2665次 ]

【摘要】目的：探讨从微量福尔马林固定石蜡包埋组织（formalin fixation and paraffin embedded tissues，FFPET)中提取DNA的简单而高效的方法。方法：采用Chelex100提取法、酚氯仿抽提法、单纯消化法、水煮法4种方法提取组织DNA；应用聚合酶链反应扩增100～500bp长度DNA片段，然后进行电泳分析，1年后重复PCR电泳分析。结果：小于200bp长度DNA片段扩增，Chelex100提取法、单纯消化法阳性率分别为88.8%、78.8%，明显优于酚氯仿抽提法（15.0%）（P<0.01）及水煮法（21.3%）（P<0.01）。随着扩增长度的增加，PCR扩增效率逐渐降低，Chelex100提取法PCR反应总阳性率为82.5%，单纯消化法为66.5%，水煮法为13.4%，酚氯仿抽提法为13.4%。1年后重复PCR总阳性率分别为80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。结论：Chelex100提取法方便简单，适用于微量石蜡组织DNA扩增分析；单纯消化法及水煮法在一定条件下适用于微量石蜡组织短片段DNA的扩增。

【关键词】石蜡组织;DNA提取;Chelex100提取法

［ABSTRACT］ Objective: To explore the simple and effective method for DNA extraction from microamount formalin fixation and paraffin embedded tissues (FFPET). Methods: The DNA was extracted by four different methods: Chelex100 extraction, phenolchloroform purification, simple digestion method and water cooking method. The DNA fragment with 100500 bp length was amplified by PCR. It was analyzed by electrophoresis, and the procedure including PCR and analysis was repeated 1 year later. Results: For amplification of DNA less than 200 bp, the positive rates of Chelex100 group and simple digestion group were 88.8% and 78.8%, respectively, which were significantly effective than phenolchloroform purification group (15.0%) (P<0.01) and water cooking group (21.3%) (P<0.01). The amplication efficacy decreased as the length increase. The total positive rates of PCR were 82.5% in Chelex100 group, 66.5% in simple digestion group, 13.4% both in water cooking group and phenolchlorform group. And the positive rates in repeated assessment were 80.1%, 31.7%, 2.5% and 9.2%. Conclusions: Chelex100 extration method is easy and applicable in amplification analysis of DNA extracted from mircoamount paraffin embedded tissues; while simple digestion method and water cooking method are suitable to analysis of short length DNA fragment extracted from mircoamount paraffin embedded tissues.

［KEY WORDS］ Paraffin embedded tissue; DNA extraction; Chelex100 extraction
医院病理科存在大量各种疾病甲醛固定石蜡包埋组织（formalin fixed and paraffin embedded tissues， FFPET），为分子病理研究提供了大量的信息来源。然而福尔马林固定后的蜡块包埋组织DNA降解严重［1］，档存FFPET组织切取量有限，传统酚氯仿提取DNA步骤繁杂，提取过程损失严重等都制约了石蜡组织在分子病理学中的研究应用［2］。如何高效、高质量提取微量石蜡组织DNA对利用石蜡组织进行分子研究至关重要。本实验在前人及前期研究的基础上［3］，进一步探讨改善石蜡包埋组织DNA的提取方法及各种方法在不同条件下的应用。期刊论文发表网

1 材料与方法

1.1 材料

选用海南医学院附属医院病理科2006～2007年间存档的胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、结肠癌石蜡包埋组织各25例。所用物品包括PCR仪(Biometra)、蛋白酶K(Merck公司)、Taq DNA聚合酶(北京华美)、Chelex100(BioRad I～boratory)。

1.2 方法

黄幼生等.四种微量石蜡组织DNA提取方法的比较
1.2.1 提取DNA方法将每例石蜡包埋组织块切片6μm厚，分装于4个EP管中，每管5片(鼻咽癌组织10片)，切不同病例的蜡块时用二甲苯擦洗刀片2遍，以免交叉污染。先统一去蜡：在每管中加入二甲苯1mL置于55℃恒温摇床中，20min后12000r/min离心10min，去上清，加入新鲜二甲苯重复一次；再用无水乙醇洗涤2次以脱去二甲苯，离心后弃上清，在55℃恒温箱干燥沉淀。采用4种方法提取DNA：（1）单纯消化法：用100μL的组织裂解液（0.2%SDS，10mmoL/L TrispH8.0，0.5mmoL/LEDTApH 8.0）悬浮沉淀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)消化，55℃振摇8h或过夜至溶液澄清。98℃加热10min灭活蛋白酶K，冰上3min，12000r/min 离心取上清（DNA在上清液中），4℃储存备用。（2）Chelex100提取法：步骤同单纯消化法，提取上清后，在上清液中加入5%Chelex100颗粒，4℃过夜储存备用。（3）酚氯仿抽提法：在EP管中加入200 mL蛋白酶K缓冲液(50 mmol/L TrisHCl pH 8.0，5 mmol/LEDTA pH 8.0，0.2%Tween20)及5 μL 蛋白酶K(20mg/mL)，置55℃水浴振摇过夜，取出后煮沸10min，离心，取上清；用等量酚—氯仿—异戊醇抽提2次；加2.5倍冰无水乙醇(-20℃)和1/10体积3mol/L乙酸钠沉淀DNA，-20℃静置

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