浅谈禽用疫苗安全性的检测方法
作者:顾的乐时间:2015-12-28 13:55:44 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:1049次 ]
【内容摘要】：疫苗是一种特殊药品，其质量优劣直接关系到畜禽疾病预防的有效性和安全性，也关系到对人类健康和生态环境的影响。因此对疫苗的生产、经营和使用必须有严格的监督管理和检测。
【关键词】: 疫苗 安全 检测
疫苗(Vaccine) 指的是由病原微生物、寄生虫以及其组分或代谢产物所制成的，通过疫苗免疫是最有效的防控疫病措施之一。
疫苗是一种特殊药品，其质量优劣直接关系到畜禽疾病预防的有效性和安全性，也关系到对人类健康和生态环境的影响。因此对疫苗的生产、经营和使用必须有严格的监督管理和检测。我国疫苗的检测是按照农业部颁布的《兽医生物制品及检验规程》来进行，疫苗的检测包括安全检验、效力检验、物理性状检验等相关检验。为了保证在养禽生产中使用安全高效的禽用疫苗，各养殖场须在疫苗使用前进行安全性检测。
目前，禽用活疫苗外源病原检测项目有。
1 无菌检验或纯粹检验
1.1 无菌检验
厌氧性及需氧性细菌的检验用硫乙醇酸盐培养基（T.G） 及酪胨琼脂（G.A）；霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白胨培养基（G.P）。
1.2 灭活检验
用适于本菌生长的培养基或对本毒敏感的细胞、组织和动物。
1.3 检验方法及结果判定
（1）含甲醛、苯酚、汞类等防腐剂和抗生素的制品用T.G 培养基 50ml，接种样品 1ml （冻干制品先用 5ml 生理盐水稀释）， 置37℃培养，3 日后自小瓶中吸取培养物分别接种T.G 小管和G.A 斜面各2 支，每支0.2ml，1 支置37℃ ,1 支置25℃ ；另取0.2ml 接种1 支G.P 小管置25℃，均培养5 日，应无菌生长。
（2）细菌性活疫苗及不含防腐剂、抗生素的其它制品或稀释液将样品直接接种T.G 小管和G.A 斜面各2 支，每支0.2ml， 1 支置37 ℃ ,1 支置25℃ ；另取0.2ml 接种1 支G.P 小管置25℃，均培养5 日，细菌性活疫苗应纯粹，其他制品应无菌生长。
2 杂菌计数
2.1 样品稀释
随机抽取3 瓶试验样品，用酒精棉消毒瓶塞后加入TSB 培养基对疫苗进行稀释，最终使接种疫苗稀释液为10 羽份/0.3ml。
2.2 接种
取10 块GA 培养基平皿，在平皿上做好标记，每个样品接种3 个平皿，每平皿接种0.3ml，倾斜平皿让接种物均匀分布到琼脂表面，设一阴性对照。置37℃培养箱培养48h 后转移至25℃培养箱内培养24h。
2.3 计数
将培养结束的平皿取出，分别计算杂菌数，如果污染霉菌亦作为杂菌计数。根据平皿上的细菌数和霉菌数以及每块平皿上接种的疫苗羽份数量，用下面的公式计算每个样品每羽份所含的杂菌数。
每羽份杂菌数（杂菌数/ 份数）=
S1、S2、S3: 为第一、二、三块平皿杂菌数。D ：为每块平皿上接种的疫苗杂菌数。
2.4 结果判定
阴性对照平皿无菌生长，实验有效。任何一瓶待检样品每羽份疫苗杂菌不超过1 个为合格，3 个样品中任何一个样品每羽份杂菌计数超过1 个菌，则该产品不合格。
3 外源病毒检验—鸡胚法
3.1 检测方法
（1）鸡胚检测法分为：绒毛尿囊膜接种（CAM）和尿囊腔接种(AS)。
（2）鸡检查法：用鸡胚检测无结果或可疑时，可用鸡检1 次，检查临床反应及某些病原的抗体反应。
3.2 外源病毒检验时样品稀释的稀释与中和
每批疫苗取样2 瓶，将待检样品稀释成每毫升含250 羽份（1000 羽份疫苗加入4ml 无菌PBS 溶液），混合2 瓶疫苗稀释液， 取出 1ml （250 羽份），加入 3ml 相应的抗血清，室温中和 1h，接 种前再加入1ml PBS 使总体积为5ml。如为联苗则需加入每种抗血清各2ml 中和1h。
3.3 接种
鸡胚源疫苗与相应抗血清混合室温中和1h 后，取9-11 日龄SPF 鸡胚10 只，通过CAM 和AS 2 个途径分别接种鸡胚10 只，每胚接种0.2ml。放置孵化机中孵化7 天，24h 内死亡鸡胚不计，孵化7 天后每组至少存活8 个胚试验才有效。
3.4 结果判定
7 天后，打开所有鸡胚（包括24h 后死亡鸡胚）进行解剖观察，鸡胚发育正常，绒毛尿囊膜无病变，尿囊液HA 为阴性。则检验样品合格。如果因为外源病毒引起鸡胚死亡或病变，则该批疫苗不合格。
4 外源病毒检验—RT-PCR 检测方法
4.1RNA 的抽提
按照RNA 抽提试剂盒说明书进行
4.2RT-PCR 反应液的配制
反应体系：使用TaKaRa PrimeScript One step RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa Code ：DRR055A）PCR 试剂盒，反应体系为25ul 体系，具体如下：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1ul ；2×1 Step Buffer 12.5ul ；S1、S2 各1ul ；模板RNA 3ul ；Rnase Free 6.5ul。
4.3RT-PCR 反应程序
逆转录：50℃ 30min；预变性：92℃ 4min；扩增30 个循环（包括：变性：94℃ 30sec ；退火：55℃ 30sec ；延伸：72℃ 45sec）； 最后延伸72℃ 10min。
4.4 琼脂糖凝胶电泳
（1）用1×TAE 缓冲液配制琼脂糖凝胶：准确称取琼脂糖1g，加入100ml 1×TAE 缓冲液。在微波炉上加热至沸腾，待冷却至60℃左右时，加入1ul Gold View，摇匀；将凝胶倒入预先准备好的制胶板上，置室温冷却待用。
（2）取PCR 产物（5~10ul）与Loding Buffer 按使用比例混合均匀后加至样品孔中，其中一孔加入Maker，然后进行电泳，电压为80V，电泳时间约为30~45min ；取出凝胶在紫外灯下观察结果。
目前，国内禽用疫苗生产厂家的生产能力良莠不齐，生产疫苗所用的原料来源不清，疫苗出厂时把关不严，导致大量的问题疫苗流入市场。据中国兽医药品监察所1996 ～ 2000 年对666 批禽疫苗进行抽检，合格率仅为85％。近年来，我国一些鸡群在免疫禽用活疫苗后发生了肿瘤病，这是否与疫苗污染肿瘤病毒有关，特别是与制苗所用鸡胚受到外源病原的污染有关。因此，疫苗的安全性检测至关重要，应引起各方的重视，其检测方法，应在各养殖场广泛推广使用，为防止问题疫苗流入市场， 杜绝问题疫苗造成养禽业的损失发挥应有的作用，保证养禽业稳步高效的发展。
【关键词】: 疫苗 安全 检测
疫苗(Vaccine) 指的是由病原微生物、寄生虫以及其组分或代谢产物所制成的，通过疫苗免疫是最有效的防控疫病措施之一。
疫苗是一种特殊药品，其质量优劣直接关系到畜禽疾病预防的有效性和安全性，也关系到对人类健康和生态环境的影响。因此对疫苗的生产、经营和使用必须有严格的监督管理和检测。我国疫苗的检测是按照农业部颁布的《兽医生物制品及检验规程》来进行，疫苗的检测包括安全检验、效力检验、物理性状检验等相关检验。为了保证在养禽生产中使用安全高效的禽用疫苗，各养殖场须在疫苗使用前进行安全性检测。
目前，禽用活疫苗外源病原检测项目有。
1 无菌检验或纯粹检验
1.1 无菌检验
厌氧性及需氧性细菌的检验用硫乙醇酸盐培养基（T.G） 及酪胨琼脂（G.A）；霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白胨培养基（G.P）。
1.2 灭活检验
用适于本菌生长的培养基或对本毒敏感的细胞、组织和动物。
1.3 检验方法及结果判定
（1）含甲醛、苯酚、汞类等防腐剂和抗生素的制品用T.G 培养基 50ml，接种样品 1ml （冻干制品先用 5ml 生理盐水稀释）， 置37℃培养，3 日后自小瓶中吸取培养物分别接种T.G 小管和G.A 斜面各2 支，每支0.2ml，1 支置37℃ ,1 支置25℃ ；另取0.2ml 接种1 支G.P 小管置25℃，均培养5 日，应无菌生长。
（2）细菌性活疫苗及不含防腐剂、抗生素的其它制品或稀释液将样品直接接种T.G 小管和G.A 斜面各2 支，每支0.2ml， 1 支置37 ℃ ,1 支置25℃ ；另取0.2ml 接种1 支G.P 小管置25℃，均培养5 日，细菌性活疫苗应纯粹，其他制品应无菌生长。
2 杂菌计数
2.1 样品稀释
随机抽取3 瓶试验样品，用酒精棉消毒瓶塞后加入TSB 培养基对疫苗进行稀释，最终使接种疫苗稀释液为10 羽份/0.3ml。
2.2 接种
取10 块GA 培养基平皿，在平皿上做好标记，每个样品接种3 个平皿，每平皿接种0.3ml，倾斜平皿让接种物均匀分布到琼脂表面，设一阴性对照。置37℃培养箱培养48h 后转移至25℃培养箱内培养24h。
2.3 计数
将培养结束的平皿取出，分别计算杂菌数，如果污染霉菌亦作为杂菌计数。根据平皿上的细菌数和霉菌数以及每块平皿上接种的疫苗羽份数量，用下面的公式计算每个样品每羽份所含的杂菌数。
每羽份杂菌数（杂菌数/ 份数）=
S1、S2、S3: 为第一、二、三块平皿杂菌数。D ：为每块平皿上接种的疫苗杂菌数。
2.4 结果判定
阴性对照平皿无菌生长，实验有效。任何一瓶待检样品每羽份疫苗杂菌不超过1 个为合格，3 个样品中任何一个样品每羽份杂菌计数超过1 个菌，则该产品不合格。
3 外源病毒检验—鸡胚法
3.1 检测方法
（1）鸡胚检测法分为：绒毛尿囊膜接种（CAM）和尿囊腔接种(AS)。
（2）鸡检查法：用鸡胚检测无结果或可疑时，可用鸡检1 次，检查临床反应及某些病原的抗体反应。
3.2 外源病毒检验时样品稀释的稀释与中和
每批疫苗取样2 瓶，将待检样品稀释成每毫升含250 羽份（1000 羽份疫苗加入4ml 无菌PBS 溶液），混合2 瓶疫苗稀释液， 取出 1ml （250 羽份），加入 3ml 相应的抗血清，室温中和 1h，接 种前再加入1ml PBS 使总体积为5ml。如为联苗则需加入每种抗血清各2ml 中和1h。
3.3 接种
鸡胚源疫苗与相应抗血清混合室温中和1h 后，取9-11 日龄SPF 鸡胚10 只，通过CAM 和AS 2 个途径分别接种鸡胚10 只，每胚接种0.2ml。放置孵化机中孵化7 天，24h 内死亡鸡胚不计，孵化7 天后每组至少存活8 个胚试验才有效。
3.4 结果判定
7 天后，打开所有鸡胚（包括24h 后死亡鸡胚）进行解剖观察，鸡胚发育正常，绒毛尿囊膜无病变，尿囊液HA 为阴性。则检验样品合格。如果因为外源病毒引起鸡胚死亡或病变，则该批疫苗不合格。
4 外源病毒检验—RT-PCR 检测方法
4.1RNA 的抽提
按照RNA 抽提试剂盒说明书进行
4.2RT-PCR 反应液的配制
反应体系：使用TaKaRa PrimeScript One step RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa Code ：DRR055A）PCR 试剂盒，反应体系为25ul 体系，具体如下：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1ul ；2×1 Step Buffer 12.5ul ；S1、S2 各1ul ；模板RNA 3ul ；Rnase Free 6.5ul。
4.3RT-PCR 反应程序
逆转录：50℃ 30min；预变性：92℃ 4min；扩增30 个循环（包括：变性：94℃ 30sec ；退火：55℃ 30sec ；延伸：72℃ 45sec）； 最后延伸72℃ 10min。
4.4 琼脂糖凝胶电泳
（1）用1×TAE 缓冲液配制琼脂糖凝胶：准确称取琼脂糖1g，加入100ml 1×TAE 缓冲液。在微波炉上加热至沸腾，待冷却至60℃左右时，加入1ul Gold View，摇匀；将凝胶倒入预先准备好的制胶板上，置室温冷却待用。
（2）取PCR 产物（5~10ul）与Loding Buffer 按使用比例混合均匀后加至样品孔中，其中一孔加入Maker，然后进行电泳，电压为80V，电泳时间约为30~45min ；取出凝胶在紫外灯下观察结果。
目前，国内禽用疫苗生产厂家的生产能力良莠不齐，生产疫苗所用的原料来源不清，疫苗出厂时把关不严，导致大量的问题疫苗流入市场。据中国兽医药品监察所1996 ～ 2000 年对666 批禽疫苗进行抽检，合格率仅为85％。近年来，我国一些鸡群在免疫禽用活疫苗后发生了肿瘤病，这是否与疫苗污染肿瘤病毒有关，特别是与制苗所用鸡胚受到外源病原的污染有关。因此，疫苗的安全性检测至关重要，应引起各方的重视，其检测方法，应在各养殖场广泛推广使用，为防止问题疫苗流入市场， 杜绝问题疫苗造成养禽业的损失发挥应有的作用，保证养禽业稳步高效的发展。
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