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低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

作者:时间:2011-01-11 10:28:51 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:974次 ]

【摘要】　　目的利用低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞定向分化。方法分离人骨髓，利用梯度离心法进行MSCs的培养，取第三代细胞利用低强度间断负压诱导分化；倒置显微镜下观察细胞的形态，检测碱性磷酸酶(ALP)活性，茜素红染色观察钙结节形成，免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和骨保护素的表达。结果低强度间断负压诱导2周后，细胞呈现出成骨细胞形态，ALP活性明显增强，茜素红染色可见钙结节形成，Ⅰ型胶原和骨保护素表达阳性。结论利用低强度间断负压可以成功的诱导MSCs向成骨细胞定向分化，诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性。

【关键词】负压骨髓间充质干细胞成骨细胞诱导

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effect of low-intensity interrupted negative pressure on the differentiation of human marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into osteoblast in vitro. Methods MSCs were isolated from adult marrow using density gradient separation method, passage 3 cells were chosen to induce differentiation; the differentiation of MSCs was examined by phase-contrast microscopy, the determination of alkaline phosphatase (ALP) activities, alizarin-red staining and the immunohistochemistry of typeⅠcollagen and osteoprotegerin. Results MSCs showed a typical appearance of osteoblasts after 2 weeks induction by low-intensity interrupted negative pressure, the activities of ALP were increased significantly, calcium nodes were seen by alizarin-red staining, the expressions of collagen typeⅠ and osteoprotegerin were positive. Conclusion Low-intensity interrupted negative pressure could successfully induce human MSCs into osteoblasts and the induced cells show characteristics of osteoblasts.

　　KEY WORDS: negative pressure; marrow mesenchymal stem cell; osteoblast; induction

　　近年来，负压封闭引流技术(vacaum assisted closure, VAC)在外科创面处理方面取得了巨大的成功，该项技术能改善创面血供促进创面愈合［1］。负压技术对骨组织有何作用以及作用的机制如何，能否用来促进骨折愈合、治疗骨坏死等方面，国内外尚无学者对其进行研究。本研究在预实验的基础上通过观察低强度间断负压对人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)诱导分化的影响，以阐述其作用机制，为今后在骨折愈合和骨坏死方面的研究提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料教师论文发表

　　骨髓2例取自我科诊断为髋关节骨性关节炎，行人工关节置换的手术患者，年龄分别为56岁和61岁。两例患者肝肾功能正常，无代谢性骨病及传染病，手术前经患者同意，术中截骨后经骨髓腔抽取骨髓5mL，吸入预先加有肝素的针筒备用。

　　1.2 主要试剂与仪器

　　L-DMEM培养基、胰蛋白酶均为Gibco产品，Percoll分离液为Sigma产品(1.073 g/mL)，胎牛血清(杭州四季青)，Ⅰ型胶原和骨保护素免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，完全培养基的组成：L-DMEM培养基加入100 mL/L胎牛血清，青、链霉素终浓度为100 u/mL，微型负压仪。

　　1.3 细胞原代培养

　　细胞采用梯度离心法进行培养：将抽取的骨髓分装入离心管，加入 L-DMEM培养基2 mL，1 500 r/min离心5 min去除上层脂肪滴和上清，以D-Hanks液重悬细胞后平铺于Percoll分离液上，1 500 r/min离心10 min，吸取中间层的白膜层(单核细胞层)，以D-Hanks液洗涤，加入L-DMEM培养基置入无菌培养瓶中，37 ℃、5%(体积分数)的CO2孵育箱培养。

　　1.4 负压诱导高级职称论文发表
　　
　　取第三代细胞进行负压诱导，把24孔和6孔培养板中培养液预先吸掉4/5，打开盖置入自行设计的无菌密闭容器中，容器侧面有孔和导管与微型负压仪相连，打开负压仪设置压力为20 kPa，30 min/次，2次/d。每次诱导完毕后取出培养板补足培养液，实验分为负压诱导组和正常培养组。

　　1.5 细胞观察

　　倒置显微镜下每日观察细胞的生长情况和形态特点，拍照记录。

　　1.6 碱性磷酸酶活性的测定

　　诱导2周后，两组细胞用考马斯亮兰微板法测定每孔中细胞蛋白含量，采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)试剂盒测定细胞ALP活性，定量测定两组细胞中平均每毫克蛋白质的ALP活性变化，比较两组的差异。

　　1.7 茜素红染色

　　诱导2周后，倒掉培养液，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3遍，茜素红染色8 h，显微镜下观察阳性结果。

　　1.8 免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和骨保护素的表达
　　诱导2周后，细胞用40 g/L多聚甲醛固定20 min，进行Ⅰ型胶原和骨保护素免疫组织化学检测，一抗为鼠抗人Ⅰ型胶原和骨保护素单克隆抗体，DAB显色。

　　1.9 统计学处理

　　应用SPSS11.0统计软件进行数据分析，结果用均数±标准差( ±s)表示，以t检验进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

　　2.1 倒置相差显微镜所见的细胞形态的变化

　　用间断负压诱导的细胞增殖速度略低于正常培养组细胞，细胞形态逐渐由梭型向多角型转化，带有数个突起，数目和形态不定，10-14 d细胞融合成单层，2周后逐渐形成多个散在的致密岛状结构，而正常培养组细胞的形态大部分为梭型。诱导成功后，细胞1周左右传1代，可稳定传10代。