生姜透皮贴对运动病大鼠脑组织中三种酶活性的影响
【摘要】 目的 通过建立运动病模型，检测生姜透皮贴对运动病大鼠脑组织中碱性磷酸酶(AOP)、Na+K+ATP酶和细胞色素氧化酶(CCO)活性的变化，并探讨其治疗运动病的机制。方法 雄性SD大鼠40只，随机分5组，每组8只，每天按实验方法刺激，同时实验组给予生姜透皮贴治疗。实验第3天刺激结束后迅速断头处死，冰上迅速分离脑组织，取大脑皮质和小脑皮质、脑干前庭区。采用组织化学定位方法和图像定量分析方法，检测各组大鼠上述三部位脑组织中ALP、Na+K+ATP酶及CCO活性。结果 运动病大鼠三部位脑组织中ALP活性显著升高、Na+K+ATP酶及CCO活性明显降低。与模型组相比，使用生姜透皮贴后运动病大鼠三部位脑组织中ALP活性显著减低、Na+ K+ATP酶及CCO活性明显升高。结论 生姜透皮贴可能通过降低脑血管紧张度，改善脑血流的分布，增加脑血流量，调整脑细胞内CCO、ALP、Na+K+ATP酶等酶的活性，增强脑细胞的兴奋性，从而保持中枢神经系统的兴奋性，起到抗运动病的作用。
【关键词】 生姜透皮贴;运动病;碱性磷酸酶;Na+K+ATP酶;细胞色素氧化酶
随着现代航天航海事业的发展，世界各国都在开展运动病的研究工作，对防治运动病的研究已经取得了一定的成果，但尚无公认的疗效确切、副作用少的治疗措施。寻找更为有效、更安全的抗运动病方法日益引起国内外重视。目前的抗运动病药物主要包括抗胆碱、抗组胺类及拟交感胺类等，虽有一定的抗运动病作用，但多有中枢抑制作用，限制了其临床使用。而我国自古就应用中草药生姜抗眩晕病，生姜有确切的抗运动病防止晕车、晕船的作用〔1〕。美国科学家也证明生姜确有防晕船等效果〔2〕，且相对其他防晕船药物相比，无口干，昏睡，血压降低等副作用。近年来，国内学者进行的动物实验证实，生姜的有效成分有明显的止吐抗运动病的作用〔3〕，且无明显副作用。南通医学院航海医学研究所与南通市中医院联合研究的生姜合剂由生姜、半夏等6味中药组成〔4〕，及单独的生姜粉等用于防治运动病，效果较晕海宁强，副作用不明显，因而生姜成为各国学者普遍看好的新的抗运动病药物。本实验运用乙醇法提取生姜有效成分，将其与透皮剂氮酮混合制成帖剂贴在运动病大鼠的脐部〔5〕，测定大鼠大脑皮质、小脑皮质、脑干前庭区脑细胞中Na+K+ATP酶、碱性磷酸酶(ALP)、细胞色素氧化酶(CCO)活性变化〔6〕，透皮疗法使药效发挥更加持久，而且方法简便，作用迅速〔7〕，为抗运动病新型药物的研究提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 雄性SD大鼠40只、体重(200±10) g，购自湖北省实验动物中心，动物合格证号：SYXK(鄂)20030007，检疫后备用。单笼饲养，自由摄食水，饲养1 w后开始实验。随机分5组，分别是正常组、模型组和生姜高、中、低剂量组，每组8只。模型组和生姜组大鼠脐部脱毛，每天将透皮贴贴在脐部，给药30 min。随后给予2 h的运动病刺激：将大鼠无束缚地放入旋转装置中的有机玻璃笼内，先顺时针方向加速度从16°/S2加速至120°/S2，然后立即以45°/S2减速至0，马上逆时针再以16°/S2加速至120°/S2，然后以45°/S2减速至0，如此反复。旋转时间为2 h〔8〕，除正常组不接受旋转刺激外，其他各组处理相同，旋转刺激完成后动物放回饲养笼中。连续刺激3 d，1次/d。每天观察动物接受刺激后的反应情况，第3天刺激结束后取动物迅速断头处死，冰上迅速分离脑组织，取出大鼠三部位脑组织，放入液氮，转入-80℃冰箱备用。中国论文发表
1.2 药品与材料 生姜透皮贴：生姜(华中科技大学鉴定)清洗去杂切碎，双蒸水浸泡，闪式提取器提取，过滤，滤液减压浓缩至浸膏状，按50、100和200 mg/kg将生姜浸膏与氮酮混匀，制成3 cm×4 cm生姜透皮贴，另用氮酮制作空白贴剂供模型组使用。ALP试剂盒(批号：060101)、Na+K+ATP酶试剂盒(批号：060101)、CCO试剂盒(批号：060101)均购自南京建成生物工程研究所。
1.3 实验仪器 低温高速离心机(Backman)、电热恒温水温箱 (上海医疗器械七厂)、721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。
1.4 酶细胞化学反应 将组织用含2%多聚甲醛、0.5%戊二醛的二甲砷酸钠缓冲液固定液(pH1.4 0.1 mol/L) 4℃固定1 h。二甲砷酸钠缓冲液漂洗后，与液氮冷冻后两组样品并列放在一起,恒冷箱冷冻切片为10 μm，分别测定进行Na+K+ATP酶、ALP和CCO〔9〕。用1%锇酸固定1 h，EPON812包埋，LKB超薄片机切片，不进行电子染色，直接在HITACHIH300型电镜下观察。学术论文发表
1.5 酶活性定量分析 采用XY540型彩色图像分析系统定量分析〔10〕，128×128像素点，每张切片随机测5次，酶切片反应至少测30次，以阳性反应面积(单位为μm2)作为酶反应强度的参数，取其平均值。
1.6 统计学处理 实验数据以x±s表示，应用SPSS 12.0统计软件进行方差分析。
2 结 果
2.1 一般情况 大鼠受到运动病刺激后，自发活动明显减少，皮毛蓬松耸立，排尿排便增多。运动病刺激结束后大鼠行为表现有所恢复，约3 h后开始活动或进食。与正常组比较，生姜组和模型组大鼠消瘦，进食量未见明显改变。
2.2 各组大鼠大脑皮质三种酶活性 运动病大鼠大脑皮质Na+K+ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小，ALP阳性反应面积增大;生姜透皮贴使运动病大鼠大脑皮质中Na+K+ATP酶、CCO阳性反应面积明显增大，ALP阳性反应面积减小，见表1。表1 大鼠大脑皮质三种酶活性的图像定量分析(x±s，n=8)与正常组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同
2.3 各组大鼠脑干前庭区三种酶活性 运动病大鼠脑干前庭区中Na+K+ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小，ALP阳性反应面积增大;生姜透皮贴使运动病大鼠脑干前庭区中ALP、Na+K+ATP酶、细胞色素氧化酶阳性反应面积明显增大，ALP阳性反应面积减小，见表2。表2 大鼠脑干前庭区三种酶活性的图像定量分析(x±s，n=8)
2.4 各组大鼠小脑皮质三种酶活性 运动病大鼠小脑皮质中Na+K+ATP酶、CCO阳性反应面积明显减小，ALP阳性反应面积增大;生姜透皮贴使运动病大鼠小脑皮质区中ALP、Na+K+ATP酶、CCO阳性反应面积明显增大，ALP阳性反应面积减小，见表3。表3 大鼠小脑皮质三种酶活性的图像定量分析(x±s，n=8)
3 讨 论
大脑和小脑皮质及脑干前庭区等中枢对运动病的发病有关〔11〕。ALP和Na+K+ATP酶反应产物主要定位于以上三部位毛细血管内皮细胞膜上，也呈阳性反应。CCO反应产物主要定位于以上三部位脑细胞线粒体膜上。核心期刊论文发表
旋转刺激可引起神经细胞膜Na+K+ATP酶活性下降，ALP活性上升，线粒体CCO活性下降。这可能表明旋转刺激引起Na+K+泵效率明显下降，导致细胞膜外K+浓度上升，高浓度K+可打开神经细胞膜上电压依赖性Ca2+通道，导致Ca2+内流。神经细胞膜外高K+和细
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