熊果酸对卵巢癌细胞黏附、运动和侵袭的影响
【摘要】 目的 探讨熊果酸(UA)对人高转移卵巢癌细胞HO8910黏附、运动和侵袭的影响。方法 以不同浓度的UA处理高转移卵巢癌细胞HO8910，采用MTT法及细胞黏附人工重组基底膜实验检测UA对HO8910细胞的细胞毒作用及黏附能力的影响;Transwell小室法检测UA对HO8910细胞侵袭能力和趋化运动能力的影响。结果 不同浓度UA处理后，随着UA浓度从10 μmol/L增加到30 μmol/L，与对照组比较，对细胞黏附抑制率增强(P<0.01)，能显著降低HO8910运动能力和侵袭能力(P<0.01)。结论 UA能抑制卵巢癌细胞HO8910黏附、运动和侵袭能力。
【关键词】 熊果酸;卵巢癌;侵袭
熊果酸(UA)，属于五环三萜类化合物，研究表明具有抗炎、护肝、降血脂等多种生物学活性。近年来研究发现UA具有多种抗肿瘤的作用〔1～3〕，但其是否通过抑制肿瘤侵袭转移起抗肿瘤作用还未见报道，本研究旨在通过体外实验探讨UA对卵巢肿瘤细胞侵袭转移的影响和机制。
1 材料与方法
1.1 材料 人卵巢癌细胞株HO8910引自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院研究所;UA、二甲基亚砜(DMSO )购自Sigma公司;RPMI1640培养基、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、新生牛血清、胰蛋白酶购自杭州四季青生物工程公司;Transwell小室购自Costar公司;纤黏连蛋白购自Promega公司;Matrigel购自Becton Dickinson公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 细胞在含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640的培养液中，37℃、5%CO2孵箱中，细胞经过消化传代，取对数生长期细胞待用。
1.2.2 增殖抑制实验 取对数生长期的HO8910细胞，细胞以1×106/孔接种于96孔培养板中。将培养板放入37℃、5% CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后取出培养板，加入不同浓度UA，使其浓度分别为10、20、30、40、50 μmol/L，每个浓度设3个平行;同时设置空白对照组。培养板放回孵箱继续培养48 h，取出培养板，每孔加入MTT，培养板再放回孵箱孵育4 h。吸出上清液，加入200 μl二甲基亚砜。用酶标仪测570 nm 波长处每孔的吸光度(A)值。计算增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(对照组A值一处理组A值)/对照组A值×100%。
1.2.3 细胞黏附实验 取96孔细胞培养板，每孔加入无血清RPMI1640 稀释的Matrigel 胶溶液25 μl，37℃孵箱过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，室温干燥1 h。每孔加入2%牛血清白蛋白(BSA)20 μl，置37℃孵箱1 h，PBS 冲洗2次，室温干燥1 h。收集对数生长期的HO8910细胞，悬浮于含0.1% BSARPMI 1640培养基中，终浓度为6×108/L。用不同浓度UA预处理细胞24 h，使其终浓度分别为10、20、30 μmol/L，每孔加入预处理细胞100 μl，对照组加入等量的PBS，置孵箱内1 h，弃去未黏附的细胞，MTT法测570 nm处测A值。每组设3个平行孔，实验重复3次。按下式计算细胞黏附抑制率。 细胞黏附抑制率=(1-给药组A 值/对照组A值)×100%。
1.2.4 细胞侵袭实验 细胞侵袭重建基底膜实验在Transwell小室中进行。在小室的聚碳酸滤膜PVPF膜的外表面涂趋化剂5 μg纤黏连蛋白，在膜的内表面涂5 μg Matrigel。在24孔板内加入0.1% BSARPMI 1640，每孔600 μl。收集对数生长期的HO8910细胞，悬浮于含0.1% BSARPMI 1640培养基中，终浓度为1×109/L。将Transwell小室浸于24孔板的条件培养基中，每个小室加细胞悬液100 μl，再分别加入不同浓度UA，其浓度分别为10、20、30 μmol/L，对照组加入等量的PBS。37℃，5% CO2温箱培养24 h。用棉签擦尽膜的内表面未穿过膜的细胞。随机选择5个400倍显微视野，统计视野中侵袭至滤膜下表面的细胞数目，计算平均值。按下式计算药物对肿瘤细胞侵袭的抑制率：抑制率=对照组平均侵袭细胞数-给药组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数×100%。
1.2.5 细胞运动实验 聚碳酸滤膜内表面不铺Matrigel,其余操作同细胞侵袭实验。按下式计算药物对肿瘤细胞运动能力的抑制率：抑制率=对照组平均细胞数-给药组平均细胞数/对照组平均细胞数×100%。
1.3 统计学处理 数据用x±s表示，组间比较采用方差分析和SNKq检验。
2 结 果医学核心期刊论文发表
2.1 UA对卵巢癌细胞株HO8910细胞生长的抑制作用 MTT法结果表明，40、50 μmol/L UA处理细胞24 h及20～50 μmol/L UA处理细胞36、48 h后，明显抑制HO8910细胞的增殖(P<0.05;P<0.01)。10、20、30 μmol/L UA作用24 h，对HO8910细胞的增殖的抑制作用无显著差异(P>0.05)，见表1。
2.2 UA对卵巢癌细胞株HO8910黏附能力的影响 10，20，30 μmol/L UA作用细胞24 h时，HO8910黏附能力分别为0.389±0.074，0.371±0.043和0.312±0.011，均显著低于空白对照组(0.695±0.127)(P<0.01)，10，20，30 μmol/L UA组表1 UA对卵巢癌细胞株HO8910细胞的生长抑制作用(x±s)
2.3 UA对卵巢癌细胞株HO8910侵袭能力和运动能力的影响 结果如表2，图1所示，不同浓度的熊果酸在体外作用24 h后可以显著抑制HO8910细胞的侵袭和细胞体外趋化运动能力，实验组与对照组比较具有显著性差异(P<0.01) 。表2 UA对卵巢癌细胞株HO8910侵袭能力和趋化运动能力的影响(x±s)
3 讨 论
卵巢癌是女性三大恶性肿瘤之一，尽管采用了肿瘤细胞减灭术和多种化疗方案，但其5年生存率依然无明显改善。恶性肿瘤的侵袭、转移是引起肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因，肿瘤细胞首先通过膜表面受体黏附于由细胞间质与基底膜组成细胞外基质(ECM) 成分纤维黏连蛋白、层黏连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白上，然后以蛋白酶降解基底膜和基质，最后定向运动穿越ECM 破损处，侵入局部血管、淋巴管，最终在远离肿瘤原发生长部位的器官内形成新侵袭、转移灶。阻断肿瘤细胞的侵袭、转移是肿瘤治疗的主要途径。目前虽有一些抗肿瘤侵袭和转移的药物在临床上应用， 但效果不理想。中学物理论文发表
如何阻断肿瘤细胞的侵袭、转移，是目前治疗肿瘤的热点之一。UA广泛存在于熊果、白花蛇舌草、女贞子、乌梅等天然植物和草药中。研究表明，UA既能诱导肿瘤细胞凋亡，又能抑制正常细胞的恶变，还能干扰DNA 合成相关的酶;也可以通过碱性神经脂酶介导的caspase 3，8，9 的激活来抑制细胞增殖，并能诱导其凋亡〔4，5〕。UA还可以抑制肿瘤血管形成、抗侵袭及增强免疫功能等多种机制来抑制肿瘤的生长和扩散。本实验观察不同浓度UA处理24 h后，HO8910细胞侵袭力、趋化运动及细胞黏附率，结果显示，随着UA浓度的增加，HO8910细胞穿膜细胞数和细胞黏附明显下降，表明UA能有效抑制
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