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大鼠颈动脉球囊损伤后平滑肌细胞mTORP70S6K表达

作者:时间:2011-01-14 14:07:56 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:900次 ]

【摘要】目的探讨姜黄素对雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核糖体蛋白质S6激酶(P70S6K)在血管平滑肌细胞增殖中的作用。方法 54只雄性SD大鼠随机分为对照组、损伤组和药物干预组。颈动脉HE染色和组织病理图像分析;免疫组织化学观察PCNA与P70S6K组织表达中的病理变化;实时定量PCR检测mTORP70S6K及PCNA的mRNA表达;ELISA测定血清白介素18(IL18)水平变化。结果实验术中死亡大鼠1只，取材过程中发现动脉闭塞5只(分别为3 d药物干预组和7 d损伤组各1只，14和28 d药物干预组各2只)。 HE染色显示14 d药物干预组与损伤组相比内膜与中膜增殖厚度明显减低，组织图像分析三组之间内膜厚度差异无统计学意义，而中膜厚度差异具有统计学差异(P=0.000);免疫组化结果示对照组与损伤组及药物干预组存在差异(P=0.045);实时荧光定量PCR mTORP70S6K及PCNA的mRNA损伤组与对照组相比具有统计学意义(P<0.05);ELISA示与对照组相比姜黄素能抑制第3、7、14天药物干预组血清IL18浓度，具有统计学意义(P均<0.05)。结论姜黄素能够抑制IL18、mTORP70S6k及PCNA在损伤血管平滑肌细胞中的表达，并能抑制平滑肌细胞增殖，可能成为预防再狭窄的新药物。

【关键词】姜黄素;血管平滑肌细胞;白介素18;雷帕霉素靶蛋白;核糖体蛋白质S6激酶

　近年来，心血管病特别是冠心病的高发病率、高致残率和高死亡率给社会及居民造成沉重负担。经皮冠脉介入(PCI)已成为治疗冠心病的最有效手段之一，但是其长期获益受到了血管再狭窄的限制，Odell和Garg等〔1，2〕研究表明，支架植入术后9个月再狭窄率为5%～8%以上。药物涂层支架使再狭窄率明显下降，但晚期支架内血栓引起了人们的关注〔3〕。尽管临床上给予PCI术后双联甚至三联抗血小板药物，但再狭窄仍是支架置入术后预防的重点和难点。球囊机械损伤，冠脉再狭窄的主要原因是由于血管平滑肌细胞(VSCM)的异常增殖、迁移和纤维化。姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种主要成分，其通过下调P13K/Akt通路抑制VSMC增殖与迁移。姜黄素已用于生物可吸收支架，对PCI术后再狭窄及支架内血栓起到抗增殖及预防作用〔4〕。目前国内对雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体蛋白质S6激酶(P70S6K)与白介素18(IL18)和再狭窄关系研究未见相关文献报道。本实验在于讨论姜黄素是否能够通过降低mTORP70S6K及IL18的表达，从而降低PCI术后再狭窄的发生。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要药物及试剂 98%高效液相色谱姜黄素购于陕西森弗生物技术公司;IL18 ELISA试剂盒及RNA纯化试剂Trizol分别购于美国ADL公司与Invitrogen公司;RTPCR反转录试剂盒和PCR试剂盒购于日本Toyobo公司;PCNA和P70S6K抗体购于美国BioworlD公司，免疫组化二抗试剂盒购于中国武汉博士德公司。

　　1.2 实验方法园艺论文发表

　　1.2.1 动物分组及模型 54只(7～8周龄)无特殊病原体(SPF)级雄性SD大鼠由甘肃中医学院动物实验中心提供，体重(300±50)g。动物批号：scxk(甘) 20040006。随机分为对照组(假手术组)6只，损伤组与药物干预组(损伤加药物)各24只，又分别分为3、7、14及28 d组。戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔麻醉后，尾静脉给予肝素100 U/kg。颈前正中切开皮肤及皮下组织，动脉夹分别夹住颈总动脉和颈内动脉，在颈外动脉剪一楔形切口，插入2 F(2×20 mm)球囊(Medtronic，美国)，注入生理盐水0.2 ml使其膨胀，缓慢回拉球囊至平切口处，抽出球囊内液体，重复上述过程三次，退出球囊，结扎颈外动脉，恢复血流。庆大霉素40万U冲洗切口后缝合皮下组织及皮肤。青霉素40万U/d肌肉注射，连续3 d。普通饲料喂养，自由饮水。对照组仅切开皮肤分离皮下组织，不插入球囊，药物干预组给予姜黄素100 mg·kg-1·d-1灌胃。取材：所有动物分别在第3，7，14和28天麻醉后取全血及左侧颈总动脉后脱臼处死。全血4 000 r/min离心 20 min取上清-20℃冰箱保存;颈总动脉经肝素生理盐水冲洗后分两等份，40 g/L甲醛固定和液氮保存。

　　1.2.2 IL18检测 ELISA按试剂盒操作说明进行操作。

　　1.2.3 组织病理(HE)及图像分析及免疫组织化学将病理标本在40 g/L中性甲醛液中固定24 h后，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，间断均匀切片(片厚5 μm)。对病理切片行免疫组化染色，观察受损血管组织形态学改变、同时采用计算机全自动图像分析系统测定受损血管内膜与中膜厚度。

　　1.2.4 实时定量PCR医学核心期刊论文发表

　　1.2.4.1 引物设计与合成根据Genbank提供的基因序列及引物设计原则应用Primer Premier 5和Oligo 6引物设计软件，自行设计引物，由北京三博远志公司合成。mTOR正链5′GAATCAGACAGGCACGAAGG3′，反链 5′TCTTCTTCCAGCAAGTTCAGC3′;P70S6K正链5′AAAGAAGAGGAAGCTGT3′，反链5′CTTTAAGTGTCCCATGTCAG3′;PCNA正链5′AAAGAAGAGGAAGCTGT3′，反链 5′CTTTAAGTGTCCCATGTCAG3′;βactin正链5′TTGCTGATCCACATCTGCTG3′，反链5′GACAGGATGCAGAAGGAGAT3′。

　　1.2.4.2 Trizol法抽提总RNA与cDNA合成将100 mg血管研成匀浆，加入Trizol 1.0 ml，室温静置5 min;加入氯仿1/5体积，4℃ 12 000 g离心15 min，抽取上清约500～600 μl，加入异丙醇500 μl混匀，-20℃过夜;过夜后4℃ 7 500 r/min离心10 min，弃上清，无水乙醇1 ml洗涤2次，4 ℃ 7 500 r/min离心5 min，弃上清，室温放置25 min，加DEPC水30 μl，立即逆转录(根据试剂盒说明书进行)或保存液氮中。

1.2.4.3 PCR反应步骤 PCR反应体系为25 μl，包括蒸馏水5.5 μl;SYBR GreenⅠ12.5 μl;Plus solution 2.5 μl;上下游引物各1 μl;cDNA 2.5 μl。变性95 ℃ 15 s，退火57 ℃ 15 s，延伸72℃ 45 s，共40循环。

　　1.3 统计方法处理所有资料以x±s表示，组间数据比较采用方差分析;秩和检验分析等级资料，应用SPSS11.0软件包进行统计学分析。

　　2 结果

　　2.1 各组血清IL18结果见表1。第3、7天损伤组及药物干预组IL18水平较对照组明显增高(P<0.05)，第14天损伤组高于对照组(P<0.05)。第3、7、14天药物干预组较损伤组

　　低(P<0.05)。环保论文发表

　　2.2 HE及免疫组织化学对照组光镜下内皮细胞和内弹力膜完整，中层VSMC呈梭形，胞核小而扁。损伤组损伤后7 d光镜下管腔面有较完整的扁平内皮，增生的内膜呈均匀性或非均匀性增厚，有迁移的VSMC和少许纤维组织形成;损伤后14、

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