脐血采集后分离时间对单个核细胞玻璃化冷冻效果的影响

【摘要】  目的 探索脐血采集后单个核细胞(MNC)最佳分离和冷冻的时间窗。方法 采集脐血6份，每份按采集后分离时间分为8h组、24h组、48h组和72h组。每组标本均在分离后进行MNC计数及台盼蓝染色检测细胞活率;各时间组细胞活率在50%以上的行体外CFU形成能力检测及玻璃化冷冻。冷冻10h后解冻进行细胞活率及体外CFU形成能力检测。结果 冷冻72h组细胞活率低于其他组(P<0.05);解冻后72h组MNC计数低于24h和48h组(P<0.05);48 h以后分离的MNC解冻后细胞活率降低(P<0.05)。结论 脐血MNC采集后的48h内分离冷冻不影响细胞活率及冻存后集落形成能力。

【关键词】  脐血;分离时间;冷冻效果物理论文发表

             造血干细胞移植是迄今治疗慢性粒细胞白血病最有效的方法[1]。脐血库的建立是脐血造血干细胞能够广泛应用于临床的前提。探索简便有效的玻璃化冻存方法及低毒的冷冻保护剂已成为脐血干细胞应用的基础性要求。由于脐血采集的时间存在不确定性，对于在夜晚采集的脐血，通常会保存在4℃冰箱等待分离后冻存。了解4℃冰箱存放时间与单个核细胞(mononuclear cells，MNC)分离后冻存效果的关系将对临床应用具有指导意义。本实验对脐血采集后不同时间段的MNC玻璃化冻存前后的细胞活力及集落形成能力进行了检测，以探索适宜的脐血采集后分离、冷冻时间，为临床实际应用提供依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 脐血标本 均采自宁夏医科大学附属医院妇产科，产妇签署知情同意书。

　　1.1.2 主要试剂及耗材 Ficall淋巴细胞分离液、干细胞培养液、白细胞介素3、粒巨细胞生长因子、促红细胞生成素购自sigma公司，丙二醇(propylene glycol, PG)系进口分装,蔗糖(Sucrose)为国产分析纯。采血袋(内含柠檬酸盐抗凝剂citrate phosphate adenine dextnse, CPD A)、冷冻管、35mm培养皿采用国产产品。

　　玻璃化液：1.0 mol/L的PROH+0.5 mol/L Sucrose+2% Dextran-40;解冻液：50%胎牛血清+1M蔗糖+RPMI 1640

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组 采集脐血6份，每份按采集后MNC分离时间分为8h组、24h组、48h组和72h组。每组标本均在分离后进行MNC计数及台盼蓝染色检测细胞活率，选择各时间组细胞活率在50%以上的进行体外CFU形成能力检测及冷冻。冷冻方法采用玻璃化液进行玻璃化冷冻，解冻后进行细胞活率及体外CFU形成能力检测。

　　1.2.2 脐血采集 用密闭式收集法采集健康孕妇足月顺产的新生儿脐带血(cord blood，CB)。采用 CPD A抗凝的密闭式血袋在胎盘娩出前从脐带断端远离新生儿侧采集[2]。采集后4℃保存,根据实验要求在不同时间点分离。

　　1.2.3 脐血分离 将脐血用无菌的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)等体积稀释。无菌吸管吸取稀释后的脐血按1∶1体积，小心叠放在Ficall淋巴细胞分离液层面上，2500 r/min离心30 min，小心吸取中间云雾层细胞，加入磷酸盐缓冲液，1500 r/min 离心10 min 洗涤2次，彻底弃上清。进行单个核细胞计数和细胞的活率检测[3]。

　　1.2.4 脐血冷冻 采用两步渗透平衡法：4℃下将分离的脐血MNC 5份与预渗透保护液1份混合，渗透平衡5min，加入玻璃化冷冻保护液，使细胞悬液的冷冻保护剂达到10%丙二醇(PROH)+10%蔗糖的玻璃化液，在玻璃化液中渗透平衡1 min，投入液氮保存。

　　1.2.5 复苏方法 样品分别于冻存10d后复苏。从液氮中取出冷冻管，在37 ℃水浴中，30 s 内解冻。室温下加入解冻液。

　　1.2.6 冷冻效果的判断 通过对冷冻前后细胞存活率及体外GM-CFU形成能力的检测判断冻存效果。

　　细胞存活率的检测采用台酚蓝染色法计算每100个细胞中的活细胞百分率[4]。体外GM-CFU形成能力的检测参照薛庆善[5]的方法，即培养至15d。显微镜下观察组织生长状况，以细胞数大于40个的克隆做为一个集落，进行集落计数。

　　1.3 统计学方法

　　各组数据均以均值±标准差(±s)表示，各组间差异比较采用方差分析，用SPSS11.5软件处理。

　　2 结果物理论文发表

　　各时间组冷冻前MNC计数随分离时间延长呈现逐渐减少趋势(图1，见封4)，72h组的细胞活率明显低于其他时间组(P<0.05)，细胞活率由48h的(83.33±6.06)%降至(45.83±10.21)%，已不能满足进行CFU检测的细胞数量要求。4℃存放48 h后分离的MNC经玻璃化冷冻后细胞活率明显降低，与其他时间组相比差异有统计学意义(P<0.05)。48h之内冷冻前后均具有克隆形成能力。详见表1和图2(见封4)。表1 不同时间点分离及玻璃化冻存后脐血MNC的数量变化、活率及克隆形成能力的比较
3 讨论

　　脐血库的建立可以彻底解决脐血样本不足的问题，并为寻找适合的配型提供方便。而建立脐血库关键是要尽可能地保证脐血干细胞在冷冻复苏后各种生物学特性不受损伤，以保持造血干、祖细胞活性，使脐血干、祖细胞移植能重建患者造血功能、免疫功能和干细胞体内外增殖、分化等功能。利用比重介质为1.075～1.090之间的淋巴细胞分离液作密度梯度离心可获得淋巴细胞、造血干细胞等MNC。由于脐血采集的时间存在不确定性，对于在夜晚采集的脐血，通常会保存在4℃冰箱等待分离后冻存。因此，探索适宜的采集后分离、冷冻时间将为临床实际应用提供科学依据。

　　有研究者将脐血采集后在4℃冰箱放置4d后发现体外培养细胞集落产率明显降低[6]，但对于1～4d内不同时间点细胞活力的变化未做进一步研究。也有学者在24h内的不同时间段通过检测细胞活力及集落形成能力和CD34+回收率作了检测，发现在4℃下保存脐血24h，细胞功能无明显影响[7]，但对24h后细胞的变化未做观察。Broxmeyer[8]等发现在4℃下保存脐血24h后造血细胞功能保存良好，48～72h后存活造血细胞数量明显减少。

　　本实验中，采集的脐血在24h之内分离细胞的计数、活率及冻存后细胞活率处于稳定状态，24～48h呈下降趋势。48h后各项检测指标均明显降低。说明脐血在离开机体内环境24h内，其数目、体外增殖能力以及抗冻能力均保持良好，48h后其功能即出现明显下降。

　　以上结果表明，脐血采集后的48h内均可进行分离冷冻，但为了保证干细胞的生存质量，建议在24h之内分离冻存为宜。

【参考文献】
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　　[2] Solves, Moraga R, Saucedo E. Comparison between two strategies for umbilical cord blood collection[J]. Bone Marrow Transplantation, 2003, 31 (4):269-273.

　　[3] 高海燕,李晓鸥,朱　华.不同方法分离人脐血造血细胞的比较研究[J].长春中医药大学学报,2008，24(6)：765.

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　　[5] 薛庆善. 体外培养的原理与技术[M]. 北京：科学出版社, 2001：1559-570.

　　[6] 谭运福, 李卫民, 蒋德昭. 细胞因子及4e保存对脐血造血干/祖细胞的影响[J]. 湖南医科大学学报, 1999, 24(3)：237-238.

　　[7] Szolomicka-Kurzawa P. Improved method for delivery room collection and storage of human cord blood cells for grafting[J]. Ann Acad Med Stetin, 2001, 47:1071.

　　[8] Broxmeyer HE, Douglas GW, Hangoc, et al. Human umbicical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells[J]. Medical Sciences, 1989，86:3828.

物理论文发表