激素对小鼠胚胎体外发育的影响

摘要探讨小鼠胚胎体外发育过程中,2种激素(孕马血清促性腺激素PMSG、人绒毛膜促性腺激素HCG)对早期胚胎发育的影响。取原核期胚胎培养于不同的培养体系中,确定适合胚胎发育的最佳体外培养体系;在胚胎培养液中加入不同浓度的激素,观察激素对体外发育的影响。试验发现含10%胎牛血清的人输卵管液培养液(HTF)是该试验条件下小鼠早期胚胎发育的最佳培养液;在该培养液中添加不同浓度和不同种类的激素后,各发育阶段胚胎的发育率与未添加激素的对照组相比均有所下降,但未发现浓度依赖性。由此可认为,高浓度的PMSG和HCG对体外培养的胚胎发育有抑制作用,可降低胚胎发育到各阶段的比例,尤其是显著降低了囊胚的发生率。
　　关键词激素;小鼠胚胎;体外发育;影响

　　AbstractThe system for mouse embryo culture,and the effects of two different hormone on mouse preimplantation embryos in vitro were explored.One-cell mouse embryos were cultured in different culture media to determine the optima system,and thendifferentconcentrationhormone were added to the medium to observe the effect ofhormone on mouse embryo development in vitro. HTF +10% FBS medium was the best culture system of mouse preimplantation embryod in viting. After hormone of different concentrations and kinds were added to HTF +10% FBS medium,the development rate of different stages embryos declines compared with control group. High concentration hormone could depress development of mouse preimplantation embryos in vitro,and lessens the developmental proportion of different stage embryos,then significant decreased the occurrence of blastocyst.
　　Key wordshormone;mouse preimplantation embryos;development in vitro;effects
　　早期胚胎体外培养技术在发育生物学、胚胎移植、转基因动物等领域的研究工作中都有很重要的作用[1]。早期胚胎发育是一个复杂的过程,在此过程中,可受到各种激素的影响,激素通过不同途径来调控早期胚胎发育[2,3]。目前,在不孕治疗中经常使用到各种促排卵激素,在孕妇妊娠期间也经常使用一些激素类药物,有报道,使用不同剂量和不同种类的激素,可能影响到胚胎的质量[4-7]。另外,环境中也存在着多种激素的类似物,这些激素和激素类似物对胚胎发育的影响研究,目前还缺乏系统性,尤其是较高浓度的激素水平如何影响胚胎的发育、胚胎发育与激素的浓度之间是否存在着剂量依存性、同种激素对不同发育阶段的胚胎的影响等,这些都还不十分明了,很有必要进行深入的研究。本研究旨在以小鼠为试验动物模型,在基础胚胎发育培养液中分别加入不同种类和不同浓度的激素,以探讨其对鼠早期胚胎体外发育的影响机理。
　　
　　1材料与方法
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　　1.1试验试剂
　　孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)购自宁波第二激素厂,HTF培养液购于美国In-Vitro公司,透明质酸酶购自Vitrolife公司,BSA 粉剂购自BovomaX公司,FBS(胎牛血清)购自Gibco公司。胚胎操作液配制:CZB-HEPES(NaCl为478.9mg/100mL,KCl为36.3mg/100mL,KH2PO4为15.9mg/100mL,MgSO4为14.195mg/100mL,NaHCO3为210.0mg/100mL,C6H12O6为100.0mg/100mL,CaCl2·2H2O为25.0mg/100mL,乳酸钠(60%糖浆)为370mg/100mL,链霉素为50mg/100mL,青霉素为60mg/100mL,HEPES为238.0 mg/100mL)。使用时,添加BSA粉剂4mg/mL,过滤除菌,使用前加温,用于体外胚胎的收集和清洗操作。
　　1.2试验动物及处理
　　昆明品系性成熟小鼠,6～8周龄,购自浙江中医药大学动物实验中心,饲养于光照控制(10L∶14D)、恒温恒湿的饲养室,自由采食饮水。雌鼠于17∶30左右腹腔注射10IU孕马血清促性腺激素(PMSG),48h后腹腔注射10IU人绒毛膜促性腺激素(HCG),HCG注射后与正常雄鼠按1∶1比例合笼,次日清晨检查有无阴栓。有阴栓者于注射HCG后14～21h采用颈椎脱臼法处死小鼠。 中国论文发表
　　1.3胚胎收集
　　取出输卵管移入操作液,在体视显微镜下找到输卵管膨大部,划破输卵管膨大部使受精卵(云雾状)游离出来。用枪头吸出卵团,移入含透明质酸酶的液滴中反复吹打,镜下观察,当受精卵游离出来后,用移卵管(自制巴氏管)吸出来移入新液滴内清洗3次,备用。
　　1.4试验分组与胚胎培养
　　1.4.1检查通过2-细胞阻滞情况。收集洗净的胚胎,选择形态较好的受精卵分为2组,分别置于HTF+10% FBS和HTF+4mg/mL BSA培养液小滴中。于37℃、5% CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,24h后观察2-细胞发育情况并做好记录。
　　1.4.2检查培养体系。收集洗净的胚胎,选择形态较好的受精卵分为多组,分别置于HTF+10% FBS培养液小滴中。于37℃、5% CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,每 24h观察1次,并记录各发育阶段胚胎数目。
　　1.4.3激素对胚胎发育的影响。选择形态较好的受精卵分为多组,分别置于添加100、50、10IU/mL的HCG和100、50、10IU/mL PMSG的HTF+10%FBS培养液中。于37℃、5% CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,每24h观察发育情况,并记录各发育阶段的胚胎个数。以不添加激素的HTF+10%FBS培养液作为对照组(CK)。2结果与分析
　　
　　2.1培养液中添加FBS和BSA检查培养系统突破2-细胞阻滞效果
　　在试验体系中,分别在HTF培养液中添加胎牛血清-FBS(10%)和牛血清白蛋白-BSA(4mg/mL),检查培养系统能否突破小鼠胚胎发育的2-细胞阻滞情况,结果发现:添加FBS和选购的BSA均可以使原核期胚胎突破2-细胞阻滞,而以添加血清效果较好,在以下的试验中将选择HTF添加血清作为基础培养液(见表1)。
　　2.2培养体系检查
　　应用HTF+FBS