幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI载体的构建、融合表达及纯化

【摘要】  　　目的 构建幽门螺杆菌(H.pylori, Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表达载体，并在E.coli BL21中表达，为进一步研究UreI的功能奠定基础。方法 利用分子克隆技术以Hp DNA染色体为模板，扩增Hp UreI基因片段，将目的基因UreI与载体pET32a(+)分别经kpnⅠ和HindⅢ双酶切，纯化，连接。筛选阳性重组载体，转化大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达pET32a(+)/UreI融合蛋白。表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后，用SDS-PAGE及Western blot分析。结果 经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp UreI编码基因，由585 bp组成，与GenBank相应菌株HP AM417 609序列完全一致，无碱基突变。经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a(+)/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达，其重组融合蛋白分子量为130 ku，经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后，其纯度达95%以上，Western blot分析显示，该重组融合蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别，具有良好的反应原性。结论 成功地克隆和构建了原核表达载体pET32a(+)/UreI，并在原核细胞中得到了高效融合表达。

【关键词】  幽门螺杆菌 尿素通道蛋白(UreI) 原核表达

　　ABSTRACT: Objective  To construct the prokaryotic expression vector of the urea channel protein gene (UreI) of Helicobacter pylori and make it expressed in E.coli BL21. Methods  The target gene encoding UreI was amplified from Hp DNA by PCR, digested by restricted endonuclease enzyme of HindⅢ, KpnⅠ simultaneously, and inserted into prokaryotic expression vector pET32a(+) digested by corresponding restricted endonuclease enzyme. The recombinant plasmid was used to select and identify by restricted endonuclease enzyme digestion and sequence analysis and transform, meanwhile induce it to be expressed in E.coli BL21 by IPTG. The recombination fusion protein was purified by 6-His marked Ni-TEDTM kit and analysed by Western blot. Results  Restriction endonuclease analysis and sequencing showed that the target gene was found to be 585 base pairs and had been inserted into recombinant vector. As compared with gene HP AM417 609 reported by GenBank, cloned UreI gene sequence was completely matched and composed of 585 bp. SDS-PAGE analysis showed that the recombinant plasmid pET32a(+)/UreI could be expressed in E.coli BL21, its relative molecule mass of expressed product was 130 ku. After purified with Ni-NTA agarose resin, the purity of recombinant fusion protein was about 95%. Western blot results showed that the recombinant fusion protein could be identified by anti-6-His monocloned antibody, suggesting that this fusion protein has good reactionogenicity. Conclusion  The gene coding for UreI is cloned and expressed successfully.

　　KEY WORDS: Helicobacter pylori; urea channel protein gene (UreI); prokaryotic expression

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是上消化道疾病的主要致病菌，它的感染不但与B型胃炎和消化性溃疡的发生有密切关系，而且与非溃疡性消化不良、MALT淋巴瘤和胃癌的发生也有重要关系，并已被世界卫生组织列为胃癌等肿瘤发生的相关因素［1］。Hp在我国普通人群的感染率较高(50%-80%)，并仍以每年1%-2%速度增加［2］。目前认为Hp的免疫防治将是减少胃癌以及消化性溃疡的最有效和最经济的办法。

　　幽门螺杆菌尿素通道蛋白(UreI)在Hp致病中起到了最为关键的作用。在酸性环境下，UreI激活尿素酶分解尿素产生氨，而氨的生成是Hp对抗胃酸、耐受胃酸以及在胃内定植的基础，因此UreI是Hp在胃内定植最关键的一个环节［3］。Hp的持续感染与UreI有重要的关系，抑制UreI的表达，从而抑制尿素跨膜转运，使Hp对酸不耐受，进而不能在胃内强酸环境中定居，达到根除Hp及其相关疾病的目的，因此以UreI为抗原的Hp疫苗将具有广阔的应用前景。本文对Hp尿素通道蛋白UreI基因进行克隆，构建重组质粒pET32a(+)/UreI,并在E.coli中进行表达，为进一步研究UreI的功能奠定基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  菌株和质粒

　　Hp由本校微生物学教研室提供，DH5α菌株，BL21(DE3)表达菌和pET32a(+)载体为本校病毒性肝炎所保存。限制性内切酶HindⅢ、KpnⅠ及Tag DNA聚合酶购自TaKaRa大连公司，T4DNA连接酶购自Promega公司。柱离心式胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自Omega公司。鼠抗6-His单抗、羊抗鼠IgG-HRP购自北京中山公司。

　　1.2  基因组DNA的提取 护理论文发表

　　参考文献报道［4］，取1.5 mL Hp培养物，12 000 r/min，离心2 min。取沉淀，加入567 μL的TE缓冲液，混悬。再加入100 g/L SDS 30 μL和20 g/L蛋白酶K 3 μL，于37 ℃温育1 h。依次加入5 mol/L NaCl 100 μL和100 g/L SDS 80 μL，于65 ℃温育10 min。用酚及酚/氯仿各抽提3次，收集上清液转入EP管中，加入0.6倍于上清液的异丙醇，12 000 r/min，离心15 s。取沉淀，加入700 mL/L乙醇1 mL洗涤，再以12 000 r/min离心5 min。弃上清液，将沉淀溶于100 μL TE中，于-20 ℃保存备用。

　　1.3