新型抗ErbB2、抗CD16三价双特异性抗体的构建及功能鉴定

【摘要】  　　目的 构建一种新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb。方法 构建重组载体pET22b(+)/BsAb；转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组蛋白的表达，通过包涵体复性纯化蛋白。应用悬浮培养系统扩增稳定表达抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(CG5细胞)和稳定表达抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(HG2细胞)，通过rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析柱纯化融合蛋白，应用流式细胞术分析BsAb的结合能力。结果 该BsAb可在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式高效表达，通过对重组蛋白的复性可获得高纯度的蛋白；复性后的BsAb具有与其亲本抗体相似性的结合靶抗原的能力。结论 新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb能与高表达ErbB2的乳腺癌细胞系SKBR3细胞高亲和力结合和表达CD16的人外周血单个核细胞低亲和力结合。

【关键词】  双特异性抗体 ErbB2 CD16 肿瘤免疫治疗

　　ABSTRACT: Objective  To construct a novel trivalent anti-ErbB2/CD16 bispecific antibody. Methods  The recombinant plasmid pET22b(+)/BsAb was constructed. The recombinant protein was expressed in E.coli BL21 strain (DE3) and purified by refolding. By using Spinner System, CG5 cells, CHO cells stably expressing anti-CD16 scFv-Fc fusion protein and HG2 cells, CHO cells stably expressing anti-ErbB2 scFv-Fc fusion protein were expanded. The fusion proteins were purified over rProtein A Sepharose Fast Flow Column. The binding activity of the BsAb was analyzed by flow cytometry. Results  The BsAb was efficiently expressed in E.coli BL21 strain (DE3) as inclusion bodies. High purity of recombinant protein could be obtained by refolding. The BsAb possessed the capability of binding to the target antigens as its parental antibodies. Conclusion  The novel BsAb was able to bind human breast cancer cell line SK-BR-3 highly expressing ErbB2 and human peripheral blood mononuclear cells expressing CD16.

　　KEY WORDS: bispecific antibody; ErbB2; CD16; tumor immunotherapy

　　治疗性抗体主要通过介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)和补体依赖的细胞毒性(complement dependent cytotoxicity, CDC)等机制实现对肿瘤细胞的杀伤［1-2］。目前已有多种抗体被批准用于肿瘤的临床治疗。然而，抗体的天然效应功能很弱，生理条件下血清中存在的高浓度IgG可与治疗性抗体竞争结合效应细胞表面的Fc受体(Fc receptor, FcR)，从而影响了抗体的功能。因此，提高抗体的效应功能一直是抗体工程领域的重要发展方向［1-3］。

　　双特异性抗体(bispecific antibody, BsAb)是一类具有双亲嗜性的组合抗体，具有结合两种不同特异性抗原的功能。BsAb可同时与肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原和效应细胞表面的触发分子结合，从而直接介导效应细胞对肿瘤细胞的杀伤。体内外实验研究结果表明，BsAb可介导更强的抗肿瘤活性。然而，对10余种不同的BsAb的临床实验研究发现，BsAb虽然表现出一定的疗效，但明显的毒副反应影响了BsAb的治疗剂量［4-5］。学术论文发表

　　抗体治疗一般通过静脉给药，治疗性抗体在循环中首先与效应细胞遭遇而结合于效应细胞。在抗体尚未到达靶部位之前，即可能引发效应细胞广泛活化，导致细胞因子释放综合征［6-8］。另一方面，抗体很大程度上可能是由效应细胞携至肿瘤局部，而并非在肿瘤靶部位招募效应细胞。这些问题给抗体研发工作者带来了新的思考。

　　为了使抗体能快速到达肿瘤局部，提高局部效应细胞的密度，进而产生对肿瘤细胞的有效杀伤，减少毒副作用，抗体研究者曾提出，一个理想的BsAb应当具有能高亲和力结合肿瘤细胞及单价触发效应细胞的特性。我们在前期工作中构建了一个新型的三价BsAb。这个BsAb能够与肿瘤靶抗原以双价的单链抗体(single chain Fv, scFv)形式结合，而与表达CD16的效应细胞则以单价的Fab形式结合。由于该BsAb缺乏抗体Fc区，纯化效率较低，从而影响了体内外活性研究的开展。为了克服BsAb的纯化难题，我们对该抗体的表达及纯化方案做了进一步的探索，获得了BsAb在原核细胞中的高效表达，并纯化得到可供体内外实验用的足量蛋白。通过实验证明，BsAb保留了良好的结合活性。

　　1  材料与方法

　　1.1  菌株、质粒和细胞

　　IgG1重链第一恒定区(constant region of heavy chain, CH1)和κ链恒定区(constant region of light chain, CL)基因由军事医学科学院生物工程研究所童贻刚博士提供(GenBank AF027159, X95747)；鼠抗人ErbB2 scFv cDNA由美国犹他大学药学院Yu Lei博士提供；大肠杆菌菌株BL21(DE3)、原核表达载体pET22b(+)、稳定表达抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(CG5细胞)、稳定表达抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(HG2细胞)、人乳腺癌细胞系SKBR3细胞(ATCC No. HTB-30)为本室保存。

　　1.2  试剂和培养基

　　限制性内切酶为Biolab公司产品；AMV反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、Wizard Purifection 质粒提取试剂盒为Promega公司产品；DNA片段回收试剂盒为北京鼎国生物技术公司产品；羊抗人IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG及人IgG购自北京中山生物技术公司；G418、TRIZOL总RNA抽提试剂、T4 DNA 连接酶购自GIBCO BRL公司；IPTG为Sigma公司产品；人淋巴细胞分离液为TBD公司产品；rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析柱购于Amersham Bioscience公司；Spinner System 为IBS Integra Biosci