大鼠完全性脊髓横断及坐骨神经损伤后运动终板变化
【摘要】 目的 研究完全性脊髓横断及坐骨神经损伤后损伤平面以下乙酰胆碱酯酶(AChE)、降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide ，CGRP)在骨骼肌运动终板中的变化。方法 选取57只雌性大鼠，30只制作成完全性脊髓损伤及修复模型，24只制作成坐骨神经损伤模型，通过AchE组化染色、镀银染色和CGRP免疫组织化学法观察脊髓损伤和坐骨神经损伤后AChE、CGRP在运动终板分别1 w、1、3、6、12个月的改变。结果 脊髓损伤后1 w、1个月AChE组织化学显示与正常运动终板相比无明显变化(P>0.05)。至3、6、12个月与正常相比有统计学差异(P<0.05);但12个月与6个月相比无统计学差异。脊髓损伤后3个月时，CGRP免疫染色阳性部分与正常组相比有明显统计学差异(P<0.01)。至6、12个月CGRP免疫阳性染色部位与正常相比有统计学意义(P<0.05)。而坐骨神经损伤后AChE含量下降，终板退变，CGRP含量明显降低甚至消失，镀银染色未发现改变。结论 脊髓损伤后功能相关蛋白含量下降，终板发生退变，退变程度明显较周围神经损伤后轻，这对于改善损伤脊髓功能后恢复运动功能提供了可能。
【关键词】 运动终板;乙酰胆碱酯酶;降钙素基因相关肽;脊髓损伤;坐骨神经
运动终板是运动神经元末梢与肌纤维连接的特化结构，损伤后其运动功能的恢复要依赖于运动终板结构的保存、再生、重建及其正常生理功能的恢复。运动终板的病理变化和功能与选择的治疗方法、治疗效果的评价存在着密切的关系。目前对于神经系统损伤后尤其是脊髓损伤后损伤平面以下联系效应器(骨骼肌)的神经乃至运动终板发生怎样的变化及变化程度文献报道亦有差异〔1，2〕，本研究采用组织化学、免疫组化等方法研究脊髓及坐骨神经损伤后乙酰胆碱酯酶(AChE)、降钙素基因相关肽(CGRP)在骨骼肌运动终板中的变化，探讨脊髓损伤后损伤平面以下骨骼肌的功能情况，为改善损伤后脊髓功能的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 动物模型制作 选取成年雌性Wistar大鼠57只，体重(230±20)g。随机选取30只大鼠制作完全性脊髓损伤及修复模型，另取3只作为正常对照。6%水合氯醛6 ml/kg腹腔麻醉，显微镜下打开T7～T8胸椎，暴露T9～T10脊髓，在T10脊髓节段切除一段长3 mm左右的脊髓，缝合硬脊膜、背部肌肉和皮肤，制成脊髓损伤组模型。将其余24只大鼠制作坐骨神经损伤模型，6%水合氯醛6 ml/kg腹腔麻醉大鼠，切开大鼠左侧后肢皮肤和肌肉，暴露坐骨神经;将大鼠左侧坐骨神经于梨状肌大孔下1 cm处切断，并将中枢断端旋转180°后反折，用8/0线固定于梨状肌下，防止自发性再生对实验的影响，缝合肌肉和皮肤，制成坐骨神经损伤模型。
1.2 取材和切片 脊髓损伤组大鼠于术后1 w、1、3、6和12个月，坐骨神经损伤组大鼠于术后1 w、1、2和4个月以4%多聚甲醛心脏灌流固定，取大鼠腓肠肌标本，将标本用4%多聚甲醛固定12 h后，放入30%蔗糖磷酸缓冲液1～2 d后行连续冰冻横行和纵形切片。切片厚度为35 μm，将纵切片分为两组，一组进行AChE组化染色，一组进行镀银染色;横切片行CGRP免疫组化染色。高级会计师论文发表
1.3 运动终板及周围神经纤维染色 一组切片采用改良Koelle AchE染色法，显示终板AChE;一组切片用GrosBielshowsky法显示神经末梢;另一组切片行CGRP免疫组化染色：切片0.1 mol/L PBST液中浸泡5 min，1N盐酸修复抗原，3% H2O2 10 min后血清封闭，直接加入兔来源的CGRP多克隆抗体(1∶2 000，Sigma公司)，4℃过夜。二抗生物素化的山羊抗兔IgG(1∶300，北京中山试剂公司)室温3 h，三抗(1∶300，北京中山试剂公司)，室温孵育3 h，DAB显色并于普通光学显微镜下观察。
1.4 运动终板及周围神经纤维的形态组织学观察和形态定量分析 应用Leica Qin图像分析系统测量AChE、CGRP阳性部位的透光度值及其面积。
1.5 统计学分析 用SPSS11.5 统计软件对数据进行统计分析，数值以x±s表示，采用单因素方差分析进行统计学检验。
2 结 果
2.1 AChE染色结果 正常大鼠腓肠肌运动终板为棕黑色、细颗粒状亚铁氰化铜沉淀，在纵切面上其形状为椭圆形或卵圆形，大小为20～40 μm，边缘清晰锐利，着色均匀，一根肌纤维上只能见到一个运动终板。脊髓损伤后1 w AChE组织化学显示运动终板染色均匀且色深，与正常运动终板相比无明显变化(P>0.05)。1个月时运动终板着色稍有变浅，至3月时，运动终板染色变浅，中央部分阳性着色变浅更加明显，与正常相比有统计学差异(P<0.05);6个月时着色明显变浅，在着色中央的周围尤其明显，AChE着色弥散，部分运动终板呈中央着色较深、周围着色浅、边缘锐利的空泡样改变;12个月时以终板中央变浅明显，但与6个月相比无统计学差异，终板呈均匀浅染的空泡样结构。在坐骨神经损伤的实验中，1 w时运动终板在着色、数量上与正常组无明显差别，肌纤维虽已有一定程度萎缩，但终板区AChE含量无明显改变，由于肌肉萎缩，AChE更加集中，有些部位着色比正常略深。损伤后1个月，着色开始变浅，形态也比正常稍小。损伤后4个月，腓肠肌变化更加显著，着色更浅，且不易辨认，染色更加不均匀，且由于肌纤维严重萎缩而显得大多数MEP几乎占据整个肌纤维的横径(图1)。
2.2 镀银染色结果 正常大鼠腓肠肌切片镀银染色可见神经及其分支。在脊髓损伤组各个时间点大鼠腓肠肌切片镀银染色均可清晰地看到神经及其分支，各组和各时间点之间未发现明显差别。坐骨神经损伤组动物在术后1 w(图2)至术后4个月，神经退变严重以致只能看到有部分终板银染而无神经及其分支。
2.3 CGRP免疫组化染色结果 正常组大鼠腓肠肌中可见运动终板被CGRP抗体清晰标记，显示CGRP免疫阳性标记与AChE组织化学显示的运动终板分布一致。CGRP免疫组化染色阳性部分(运动终板区域)分布较均匀，着色清晰，颜色相对较深，结构界限较清晰。脊髓损伤后1 w CGRP免疫阳性染色部分结构较清晰，但着色明显变浅;4 w时CGRP免疫阳性染色部位着色继续变浅;至3个月时，CGRP免疫染色阳性部分较之前更浅，与正常组相比有明显统计学差异(P<0.01),并且部分运动终板出现染色变模糊;至6个月时CGRP免疫阳性染色部位较前明显加深，12个月时CGRP免疫阳性染色部分着色较正常组更深，与正常相比差异显著(P<0.05)。大鼠坐骨神经损伤后1 w直到术后4个月，大鼠腓肠肌CGRP染色后均未观察到CGRP阳性标记物(图3)。
3 讨 论心理学论文发表
运动终板是连接神经和效应器(肌肉)的关键部位，正常生理情况下，运动神经元通过终板与骨骼肌相联系，支配骨骼肌完成各种生理功能。AChE主要来源于运动神经元的胞体，通过轴浆运输运送到神经终末，并释放到突触间隙，水解乙酰胆碱。研究认为周围神经离断后远端及去神经支配骨骼肌的AchE活性明显减低，之后AchE阳性反应的出现可认为是神经纤维再生标志之一。AChE活性的强弱反映运动神经元的功能状态，终板区AChE
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