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炎症因子在尿毒症大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用

作者:时间:2011-01-14 14:05:52 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:891次 ]

【摘要】目的观察尿毒症大鼠脑缺血再灌注(I/R)后炎症因子的动态变化。方法清洁级健康雄性Wistar大鼠30只，随机分为单纯尿毒症组(CRF组)6只、尿毒症合并脑I/R组(CRF+I/R组)24只，制备尿毒症模型，成模后，再取同样大鼠30只，随机分为正常对照组6只、单纯脑I/R组24只。将I/R组和CRF+I/R组大鼠再制作大脑中动脉栓塞模型，脑缺血2 h后再灌注，按再灌注后不同时间点(0、2、12、24 h)I/R组、CRF+I/R组又分为4个亚组，每个亚组6只。I/R组和CRF+I/R组按再灌注后的时间点取材，正常对照组在饲养3～7 d后取材，CRF组在成模后0～3 d取材，RTPCR法检测脑组织中TNFα、IL1β、IL6 mRNA表达情况。结果 TNFα mRNA：正常对照组与CRF组大鼠脑组织TNFα mRNA的表达差异不显著(P>0.05)，CRF组大鼠TNFα mRNA的表达较I/R组各时间点均降低(P<0.05);脑I/R两组大鼠TNFα mRNA在2 h时间点表达最强，此后逐渐下降;CRF+I/R组大鼠各时间点TNFα mRNA的表达均较CRF组、I/R组升高(P<0.05)。IL1β mRNA、IL6 mRNA：CRF组大鼠IL1β mRNA、IL6 mRNA的表达均较正常对照组升高，但差异不显著(P>0.05);与I/R组各时间点相比，CRF组大鼠IL1β mRNA、IL6 mRNA的表达均明显偏低(P<0.05);脑I/R两组大鼠脑组织中IL1β、IL6 mRNA表达随再灌注时间延长逐渐升高，至24 h达高峰;与I/R组和CRF组相比，CRF+I/R组各时间点IL1β mRNA和IL6 mRNA表达均显著升高(P<0.05)。结论炎症因子参与了尿毒症大鼠的脑I/R损伤，提示尿毒症的微炎症状态对神经系统具有一定的影响。

【关键词】尿毒症;脑缺血再灌注;炎症因子

　　近年来，随着肥胖、高血压、糖尿病及高龄人群的不断增多，慢性肾脏病(CKD)和脑血管病的发病率呈逐年增高趋势，已成为人类面临的严重公共卫生问题〔1〕。尿毒症是各种原发或继发的慢性肾脏疾病不断恶化、进展的最终阶段，此时肾脏功能严重受损，大量代谢产物在体内蓄积，加之钠水潴留，造成病人体内酸碱平衡紊乱及全身各系统功能失调，其中心脑血管系统受累最重，是影响尿毒症患者预后的主要因素;在中枢神经系统，尿毒症病人脑血管病的发病率较高，其死亡率即使在透析病人中也占很大比率。然而，有关尿毒症病人发生脑缺血再灌注(I/R)损伤后的病理生理变化及其机制尚未见报道。本文以尿毒症大鼠为研究对象，动态观察其发生脑I/R后脑组织中炎症因子的变化，从而明确尿毒症体内长期存在的微炎症状态对中枢神经系统的影响，为临床治疗尿毒症合并缺血性脑血管病提供新的理论依据。

　　1 材料与方法英文论文发表

　　1.1 实验动物清洁级健康雄性Wistar大鼠30只，体重250～280 g，实验室条件适应性喂养1 w，术前自由进食饮水，随机分为单纯尿毒症组(CRF组)6只、尿毒症合并脑I/R组(CRF+I/R组)24只，制备尿毒症模型，成模后，再取同样大鼠30只，随机分为正常对照组6只、单纯脑I/R组48只。所有4组大鼠中，除正常对照组和CRF组外，其余两组大鼠再制作大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。脑缺血2 h后再灌注，按再灌注后不同时间点(0、2、12、24 h)I/R组、CRF+I/R组又分为4个亚组，每个亚组6只。首先参照文献方法〔2〕，制备5/6肾切除尿毒症大鼠模型：10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)大鼠腹腔注射，麻醉后俯卧位固定鼠台上，于脊柱两侧肾脏部位剪毛，碘伏常规消毒皮肤，戴无菌手套，铺无菌洞巾。行左背部斜切口，剪开皮肤及肌肉，暴露左侧肾脏，剥离肾包膜，结扎(7号线)左肾上、下极，尽量结扎皮质约2/3的肾组织，切除结扎部分，立即以吸收性明胶海绵压迫止血，无明显出血后复位肾脏，缝合各层组织，术后切口碘伏消毒。术后腹腔注射青霉素7.2万U/100 g，连用3 d。1 w后进行第2次手术，在脊柱右侧斜切口，剥离肌层，结扎肾门部位，切除右侧肾脏。缝合各层组织，术后切口碘伏消毒。腹腔注射青霉素3 d(剂量同前)。此模型制备成功后，再参照文献〔3〕，制备大鼠大脑MCAO模型：用10%水合氯醛将大鼠腹腔注射麻醉后，仰卧位固定在实验台上，沿颈部中线切开皮肤，钝性分离皮下组织。解剖显微镜下分离左侧颈总动脉(CCA)，置线备用。向上分离左颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)，电凝ECA两分支甲状腺上动脉及枕动脉，在距CCA分叉处约5～8 mm处结扎ECA，于ICA及CCA近心端分别夹一微动脉夹，在ECA近分叉处留置一打好单节的丝线，勿收紧线结，在ECA结扎处与留置的丝线之间做一直径约0.2 mm的“V”型微切口，将尼龙线头自切口处轻轻插入，轻轻收紧线结，将ECA于结扎线近心端剪断，使之与颈内动脉方向一致。松开动脉夹，将尼龙线顺ECA插入到ICA颅内段。此时注意ICA在颅外有一较大的分支翼突颚动脉，避免将线插入此分支。插入深度约20 mm微遇阻力时停止，使尼龙线头端位于MCA起始处，阻断MCA的血流。收紧丝线，插线的末端固定于ECA残端外。缺血2 h后，轻轻外抽尼龙线使之头端回到ECA结扎处，即可使大脑中动脉恢复血供，实现再灌注，剪断插线皮外段，缝合颈部切口。模型判定：CRF大鼠于术后12 w麻醉后尾静脉取血，检测肾功能、血常规指标，将血清肌酐达到120 μmol/L作为CRF的指标。MCAO模型按ZeaLonga 5分制标准评分：0分，无神经缺损症状;1分，不能伸展对侧前爪;2分，行走时向偏瘫侧转圈;3分，向偏瘫侧倾倒;4分，不能自发行走，意识丧失。其中0分和4分者被剔除。实验过程中，手术不成功、造模失败及24 h内死亡的大鼠均弃之不用。用同一批次的大鼠制成合格模型后补足数目。
　1.2 取材每个亚组及正常对照组、CRF组各取6只大鼠，正常对照组在饲养3～7 d后取材，CRF组在成模后0～3 d取材。待所有模型制备成功后，每个亚组分别于再灌注后0、2、6、24 h取材。以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，快速剪开腹腔和胸腔前壁，清晰暴露出心脏和升主动脉，用连有输液管的预处理为钝圆的针头由心尖处插入左心室，并通过心腔插入升主动脉，向内快速输入预冷为4℃的生理盐水，同时用眼科剪剪破右心耳，使血液从右心耳流出，待流出液变清后，换上4℃的pH7.4的磷酸缓冲液配成的含4%多聚甲醛的固定液进行快速全身灌流固定，直到动物全身呈僵直状态。灌流结束后断头取出完整大脑，自视交叉前后冠状位取4 mm厚的脑组织放入冻存管，立即置于液氮中保存。

　　1.3 采用RTPCR法检测各组大鼠脑组织中TNFα、IL1β、IL6 mRNA表达 TNFα的上游引物：5′CGAGTGACAAGCCCGTAGCC3′，下游引物：5′GGATGAACA CGCCAGTCGCC3′，扩增片段753 bp。IL1β上游引物：5′TCCCATTAGACAGCTGCA CTG3′，下游引物：5′GCTCTGCTTGAGAGGTGCTGA3′，扩增片段383 bp。IL

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